DNA提取和定量的常见误区

展源 0 2023-05-15

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这篇文章可以帮助纠正一些常见的关于DNA（以及RNA）定量、纯度方面错误的信条。

尤其是提取像土壤这类的环境样品的情况下。提取环境土壤获取大量高纯度DNA比提取其它类型样品难度都要大，因为环境样品微生物裂解的复杂性和抑制因子的去除问题。而要定量分析从中提取得到的核酸就相对比较容易。可是如果定量、定性分析不得要领，你可能会误读结果，导致无谓反复试验甚至错过实验中产生的关键信息。

下面围绕DNA提取、定量分析方面常见的误解进行讨论。

对还是错：高A260值代表更多DNA

错！高A260值并不总是意味着高基因组DNA得率。除了基因组DNA本身，降解的DNA、RNA同样是高UV吸光率的。降解的RNA的高吸光率推高了A260的读数。样品裂解完成后采用什么DNA纯化方法决定了最终获得什么样的DNA，很多纯化方法并不能从大分子DNA中分离掉小片段DNA、RNA。

对还是错：珠磨研磨总能得到高DNA得率

错！并不是所有的样品都需要高速珠磨研磨机。只有动物组织、植物RNA提取才需要尽可能强力的研磨。除非你想把DNA切小点。提取各种环境样品基因组DNA，常用的办法是研磨珠结合涡旋振荡研磨以获得大分子量DNA。

当使用分光光度计测DNA得率，像上面所提到的那样，DNA断裂越厉害，吸光率越高。可是此吸光率并不意味着DNA得率很高。因为虚高的读数让你以为DNA浓度很高，跑qPCR的时候只用了很少量的DNA样品，结果导致更高的Cq值和样品DNA量的不正确计算。

当提取土壤微生物DNA的时候，珠磨研磨机并不总是起正面作用。在《DNA提取 I：土壤的分子生物学特性》文章中全面讨论了使用不同研磨珠、加热等方法优化真菌、孢子DNA提取。还给出了一些相关文献出版物参考文献。

检查DNA的完整性最好跑电泳结合测OD值，这样才能充分评估手上的DNA。如果你看到电泳凝胶上出现严重拖尾，说明珠磨研磨过头了。

对还是错：如果DNA样品看起来很干净，意味着不含腐植酸和富哩酸

错！腐植酸通常会让样品呈现棕色，如果你的样品有颜色，那就意味着有较多杂质污染。就算DNA样品表面上看起来比较干净，里头一样可能含有低浓度的腐植酸和富哩酸，甚至多糖污染。

在透过A260读数估计DNA得率同时，较低的260/230比值则表示DNA样品有机物污染。比值高于1.5就完美了，若低于1.0，那污染物将会明显抑制下游酶反应的进行。

对还是错：如果我的土壤样品DNA得率不高，那我需要采取更强的裂解方法

错！如果你的土壤DNA含量本身就很低，你应该提高土壤样品的起始量。土壤之间DNA得率差异很大。但如果提取的是有机质含量和微生物丰度很高的土壤样品，DNA得率通常可以达到20-30 μg每克土壤（5-7μg/PowerSoil prep）。

Whitman et. al (1998)提到极其丰富的土壤可以含1-2×109个细胞/克土壤 (1)。如果全是大肠杆菌的话，就相当于1g土壤含有5-10 μgDNA，相当于使用PowerSoil每个样可以得到1-3 μgDNA。

浓缩到最终50 ulDNA中，这微生物丰富的土壤预期DNA浓度可达到20-60 ng/μl。如果土壤中微生物基因两倍于大肠杆菌，此微生物丰富的土壤DNA得率甚至可以到40-120 ng/μl。

而我们实验室中通常处理的样品往往达不到这样顶级的微生物丰度，所以平均每个土壤样品有10-20 ng/ul得率是比较正常的。

鉴于上述信息，如果有某个提取方法可以得到远超出这个范围的DNA得率，那么里头肯定不全是DNA。要么被高吸光率的PCR抑制因子污染，要么含有很多降解RNA。

确定每次跑胶测得率，或者进行更准确的qPCR。

对还是错：PCR是检查抑制因子的最佳途径对。

唯一知道DNA样品是否含有抑制因子的办法是进行酶反应。最好是给样品做10倍梯度稀释用16SrDNA作引物，qPCR检测扩增效率。通常PCR mixes带有的背景细菌DNA会让水样对照产生背景扩增干扰，但样品之间的Cq值差异足以抵消其影响（通常在6-10个循环）。

进行qPCR，若结果是10倍梯度稀释之间差异约为3.3个循环。说明每个循环之间顺利进行倍增复制，样品不含抑制因子。若扩增从第一个未稀释样品就无法进行下去，表明DNA中含有抑制物。切忌，不要一次加入太多DNA。

起始50 ul PCR用1-2 μl或者10-100 ng即可，从这个浓度开始梯度稀释。如果样品扩增太快（低于仪器默认基线，扩增的荧光型号被荧光背景型号所掩盖），标准曲线会出问题，此时建议从10 ng开始梯度稀释。

取1 μl环境样品DNA跑PCR是另一个很好的检验办法。如果扩增失败或产物减少，则表明样品含有抑制因子。

总结

这些技术小提示不仅仅适用于土壤和水样。抑制因子导致的不准确吸光率和定量同样影响提取血液、组织样品。最佳的做法是测OD值的同时电泳跑胶，这样就既能知道DNA得率还能了解DNA的完整性。PCR和qPCR可以更准确定量gDNA以及起始样品的微生物数量。

内容来源： Super Lab

责任编辑：展源

审　　核：何发

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