【干货】吸光度测量：原理、主要部件和干扰消除

张明 2023-11-13

分光光度法是指应用分光光度计的分析方法，因其具有灵敏、准确、快速及选择性好等特点被广泛应用于实验室的元素分析，分光光度计的使用虽然简单，但是其原理及一些基础知识想必有许多小伙伴也是不了解的，今天小析姐整理了一部分分享给大家，希望能对你有所帮助。

原理

1、物质对光的选择性吸收
当光束照射到物质上时，光与物质发生相互作用，产生反射、散射、吸收或透射。若被照射的是均匀溶液，光的散射可以忽略。

（1）溶液颜色的产生
当一束白光通过某一有色溶液时，一些波长的光被溶液吸收，另一些波长的光则透过溶液。透射光或反射光刺激人眼使人感到颜色的存在。人把自身能感觉到的光定义为可见光。在可见光区，不同波长的光呈现不同的颜色，因此溶液的颜色由透射光的波长所决定。透射光与吸收光可组成白光，故称这两种光互为补色光，两种颜色互为补色。

（2）光吸收的本质
当一束光照射到某物质或其溶液时，组成该物质的分子、原子或离子与光子发生“碰撞”，光子的能量就转移到分子、原子或离子上，是这些粒子由最低能态（基态）跃迁到较高能态（激发态），这个作用称为物质对光的吸收。

被激发的粒子约在10^-⁸s后回到基态，并以热或荧光等形式释放出能量。分子、原子或离子具有不连续的量子化能级，仅当照射光光子的能量h_υ，与被照射物质粒子的基态和激发态能量之差相当时，才能发生吸收。不同物质微粒由于结构不同而具有不同的量子化能级，其基态和激发态能量差也不相同。所以物质对光的吸收具有选择性。

（3）吸收曲线
吸收曲线，也称为吸收光谱，描述了物质对不同波长的光的吸收能力。将不同波长的光透过某一固定浓度和厚度的有色溶液，测量每一波长下有色溶液对光的吸收程度（即吸光度），然后以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标作图，绘制的曲线即为吸收曲线。
不同浓度的同一物质，在吸收峰附近的吸光度随着浓度增加而增大，但最大吸收波长不变。若在最大吸收波长处测定吸光度，则灵敏度最高。因此，吸收曲线是分光光度法中选择测定波长的重要依据。

2、光吸收基本定律
即朗伯-比尔定律：
当一束平行单色光通过液层厚度为b的有色溶液时，溶质吸收了光能，光的强度就要减弱。溶液的浓度越大，通过的液层厚度越大，入射光越强，则光被吸收的越多，光强度的减弱也越显著。该定律是紫外可见分光光度法等各类吸光光度法定量分析的依据，是由实验观察得到的，不仅适用于溶液，也适用于其他均匀非散射的吸光物质。
A=lg(I/I₀)=εbc
A-吸光度；
I₀-入射光强度，cd；
I-透射光强度，cd；
ε-吸光系数，L/(mol˙cm)；
b-液层厚度（光程长度），cm；
c-有色溶液的浓度，mol/L。
其物理意义为：当一束平行单色光通过单一均匀、非散射的吸光物质溶液时，溶液的吸光度与溶液浓度和液层厚度的乘积成正比。

式中ε是吸光物质在特定波长和溶剂的情况下的一个特征常数，数值上等于浓度为1mol/L的吸光物质在1cm光程中的吸光度。ε是吸光物质吸光能力的量度，ε值越大，方法的灵敏度越高。由实验结果计算ε时，常以被测物质的总浓度代替吸光物质的浓度，实际上时表观摩尔吸光系数。

在多组分体系中，如果各种吸光物质之间没有相互作用，体系的总吸光度等于各组分吸光度之和，即吸光度具有加和性。

透光度T是透射光强度I与入射光强度I₀之比，即：
T=I/I₀
因此：A=lg(1/T)

主要部件

尽管光度计种类型号繁多，但它们都是由相同的基本部件组成的，包括光源、单色器、吸收池和检测系统。

1、光源
在测量吸光度时，要求光源发出所需波长范围内的连续光谱，要具有足够的光强度，并在一定时间内能保持稳定。

在可见光区测量时，通常使用钨丝灯作为光源。钨丝加热到白炽状态时会发出波长在320~2500nm之间的连续光谱。钨丝灯工作温度一般为2600~2870K，熔点为3680K。钨丝灯的温度决定于电源电压，电源电压的微小波动会引起钨灯光强度的很大变化，因此必须使用稳压电源。

在紫外区测量时，常采用氢灯或氘灯产生波长在180~375nm之间的连续光谱作为光源。其理想光源应具有覆盖整个紫外可见光区的连续辐射，强度应比较高，且随波长变化能量变化不大，但在实际上难以实现。氘灯辐射强度比氢灯高2~3倍，寿命也比较长。氙灯的强度一般高于氢灯，但欠稳定，波长范围180~1000nm，常用作荧光分光光度计的激发光源。

2、单色器
单色器是将光源发射的复合光分解为单色光的装置。
一般由5部分组成：入光狭缝、准光气（一般由透镜或凹面反光镜使入射光成为平行光束）、色散器、投影器（一般由一个透镜或凹面镜将分光后的单色光投影至出光狭缝）、出光狭缝。
色散器是单色器的核心部分，常用的色散元件是棱镜或光栅。
棱镜由玻璃或石英制成，玻璃棱镜色散能力强，但吸收紫外光，只能用于350-820nm波长的分析测定，在紫外区必须用石英棱镜。
光栅的特点是：色散均匀，呈线性，光度测量便于自动化，工作波段广。

3、吸收池
也称为比色皿，是盛放样品溶液的容器，具有两个互相平行、透光且具有精确厚度的平面。
玻璃吸收池光程长度一般为1cm，也有0.1-10cm的。
由于吸收池厚度存在一定误差，其材质对光不是完全透明，在做定量分析时，对吸收池应做配套性试验，试验后标记出放置方向。
紫外光区数值不跳为石英。

4、检测系统
检测系统包括检测器和记录显示装置。
检测器是一种光电转换设备，将光强度转变为电信号显示出来。
常用的检测器有光电池、光电倍增管和光二极管阵列检测器等。
光电池的光电流较大，不用放大，用于初级的分光光度计上，疲劳效应严重。
光电倍增管利用二次电子发射来放大光电流，放大倍数可高达10⁸倍，应用最为广泛。
光二极管阵列检测器由于全部波长同时被检测，扫描速度快，可在0.1s内完成对190-800nm波长范围的扫描。
记录显示装置包括放大器和结果显示装置。70年代采用数字读出装置。现代在主机中装备有微处理机或外接微型计算机，控制仪器操作和处理测量数据，装有屏幕显示、打印机和绘图仪等。

测量条件的选择

1、显色反应及显色条件的选择
进行比色分析或光度分析时，首先要把待测组分转变成有色化合物，然后进行比色或光度测定。
将待测组分转变成有色化合物的反应叫显色反应，与待测组分形成有色化合物的试剂称为显色剂。

（1）显色反应的选择
显色反应分两类，即络合反应和氧化还原反应，络合反应是最主要的显色反应。
选用的原则是：
选择灵敏的显色反应。摩尔吸光系数ε的大小是显色反应灵敏度高低的重要标志，因此应当选择生成的有色物质的ε较大的显色反应。一般来说，当ε为10⁴-10⁵时，可认为该反应灵敏度较高。
尽可能选择选择性好的显色剂。即显色剂仅与一个组分或少数几个组分发生显色反应。
显色剂在测定波长处无明显吸收。通常把两种有色物质最大吸收波长之差称为对比度，一般要求显色剂与有色化合物的对比度在60nm以上。

反应生成的有色化合物组成恒定，化学性质稳定。

（2）显色条件的选择
吸光光度法测定的是显色反应达到平衡后溶液的吸光度，因此要得到准确的结果，必须从研究平衡着手，了解影响显色反应的因素，控制适当的条件，使显色反应完全和稳定。

根据溶液平衡原理，有色络合物的稳定常数越大，显色剂过量越多，越有利于待测组分形成有色络合物。但是过量显色剂的加入有时会引起副反应，对测定反而不利。

酸度对显色反应的影响是多方面的。一种金属离子与某种显色剂反应的适宜酸度范围是通过实验来确定的。确定的方法是固定待测组分及显色剂的浓度，改变溶液pH值，测定其吸光度，作出吸光度-pH值关系曲线，选择曲线平坦部分对应的pH值作为测定条件。

显色反应一般在室温下进行，有的反应需要加热，以加速显色反应，使之进行完全。

大多数显色反应需要经过一定的时间才能完成，其长短与温度的高低有关，也会受到空气的氧化或发生光化学反应使眼色颜色减弱。因此必须通过实验作出在一定温度下的吸光度-时间关系曲线，得到适宜的显色时间。

干扰的消除

1、干扰的类型
光度分析中，共存离子如本身有颜色，或与显色剂作用生成有色化合物，都将干扰测定。
a.干扰离子本身有颜色
b.干扰离子本身无颜色，但能与显色剂反应生成稳定的配合物。若生成的配合物有色则直接干扰测定，若生成的配合物无色，也降低了显色剂的浓度，影响被测离子与显色剂的反应，而产生误差。
c.干扰离子与被测离子反应生成配合物或沉淀，影响被测离子的测定。

2、消除干扰的方法
a.控制溶液酸度。
b.加入掩蔽剂与干扰离子形成更稳定的化合物，使干扰离子不再产生干扰。
c.里用参比溶液消除某些有色干扰离子的影响。
d.选择适当的工作波长以消除干扰。
e.采用适当的分离方法。

吸光度测量条件的选择

1、入射光波长的选择
应根据吸收光谱曲线，选择溶液具有最大吸收时的波长作为入射光的波长。如显色剂与钴络合物在420nm波长处均有最大吸收峰。如用此波长测定钴，则未反应的显色剂会造成干扰而降低测定的准确度。因此必须选择在500nm波长处测定，在此波长下显色剂不发生吸收。而钴络合物则有一吸收平台。

2、参比溶液的选择
（1）如果仅待测物与显色剂的反应产物有吸收，可用纯溶剂作参比溶液。
（2）如果显色剂或其他试剂略有吸收，应用空白溶液（不加试样的溶液）作参比溶液。
（3）如试样中其他组分有吸收，但不与显色剂反应，则当显色剂无吸收时，可用试样溶液作参比溶液，当显色剂略有吸收时，可在试液中加入适当掩蔽剂将待测组分掩蔽后再加显色剂，以此溶液作参比溶液。

3、吸光度读数范围的选择
实践证明，吸光度在0.2-0.5内时，测量的相对误差最小。
可用两种方法来调整被测溶液的吸光度：
（1）控制被测溶液的浓度。如改变取样量，改变溶液的浓缩倍数或稀释倍数。
（2）选择不同的比色皿。吸光度小的溶液要用光程长的比色皿，吸光度大的溶液要用光程短的比色皿。

内容来源：食品仪器分析网络

责任编辑：展源

审　　核：何发

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