一、接种与分离方法

根据待检样品的性质、培养目的和所用培养基的种类，采用不同的接种方法。

1.平板划线分离培养法

对混有多种细菌的样品，采用划线分离和培养，使原来混杂在一起的细菌沿划线在琼脂平板表面分离，得到分散的单个菌落，以获得纯种。划线的形式有多种，可将一个平板分成四个不同面积的小区进行划线，第一区（A区）面积最小，作为待分离菌的菌源区，第二和第三区（B、C区）是逐级稀释的过渡区，第四区（D区）则是关键区，使该区出现大量的单菌落以供挑选纯种用。为了得到较多的典型单菌落，平板上四区面积的分配应是D＞C＞B＞A。

2.琼脂斜面接种法

主要用于菌落的移种，以获得纯种进行鉴定和保存菌种等。用接种环（针）挑取单个菌落或培养物，从培养基斜面底部向上划一条直线，然后再从底部沿直线向上曲折连续划线，直至斜面近顶端处止。

3.穿刺接种法

此法多用于半固体培养基或三糖铁、明胶等具有高层的培养基接种，半固体培养基的穿刺接种可用于观察细菌的动力。接种时用接种针挑取菌落，由培养基中央垂直刺至距管底0.4cm处，再沿穿刺线退出接种针。三糖铁等有高层及斜面之分的培养基，穿刺搞层部分，退出接种针后直接划线接种斜面部分。

4.液体培养基接种法

用于各种液体培养基如肉汤、蛋白胨水、糖发酵管等的接种。用接种环挑取单个菌落，倾斜液体培养管，在液面与管壁交界处研磨接种物，使细菌均匀得散落在液体培养基中。此接种法应避免接种环与液体过多接触。

5.倾注平板法

本法主要用于饮水、饮料、牛乳和尿液等样品中的细菌计数。取纯培养物的稀释液或原样品lml至无菌培养皿内，再将已融化并冷却至45-50℃左右的琼脂培养基15-20ml倾注入该无菌培养皿内，混匀，待凝固后置37℃培养，长出菌落后进行菌落计数，以求出每毫升样品中所含菌数。

6.涂布接种法

涂布法接种是一种常用的接种方法，不仅可以用于计算活菌数，还可以利用其在平板表面生长形成菌苔的特点用于检测化学因素对微生物的抑杀效应。将一定量的菌液或稀释液加到琼脂培养基表面，然后用灭菌的L型玻璃棒或棉拭子于不同的角度反复涂布，使被接种液均匀分布于琼脂表面，然后贴上药敏纸片，或直接培养，本法经培养后细菌形成菌苔。

高压灭菌锅灭菌效果的监测方法

高压锅的灭菌效果关系到最终试验结果的成败，因此，实验室要定期对高压锅的灭菌效果进行监测，目前监测的方法主要有以下3种：

1、化学指示卡

化学指示卡只能监测灭菌锅的灭菌温度，并不能准确监测灭菌时间，通过颜色变化来达到监测效果。

优点是使用方便快捷，缺点是不能准确监测灭菌时间。

如果高压锅使用的频率较高，建议每次都在需要灭菌的的材料外侧使用化学指示卡作为标识。

2、留点温度计

留点温度计标化合格后方可用于验证试验。检测前，需将温度计的水银柱甩至40℃以下。每次监测后留点温度计的温差应在1℃之间，则说明灭菌器内的温度分布是均匀的。

如果高压锅使用的频率较高，建议每个月用留点温度计对高压锅灭菌效果进行监测。

3、生物指示剂

生物指示剂是一类特殊的活微生物制品，可用于确认灭菌设备的性能，灭菌程序的验证，生产过程灭菌效果的监控等。

 1）按结构分可分为片状生物指示剂和自含式生物指示剂。一般来说都是用的自含式的多，就是里面有菌片，外面是密封的安瓿。

2）按培养时间可分为通用型生物指示剂和快速型生物指示剂。通用型生物指示剂根据芽孢复苏后指示菌种新陈代谢引起培养液pH改变，通过酸碱指示剂变色来进行判读，时间一般在24或48小时以上；而快速型生物指示剂根据芽孢复苏后的酶促反应，通过荧光进行判读，时间一般为3-4小时，同时国外正在研发更加快速的生物指示剂，有望在1小时之内得出结果。

生物指示剂也是GB15981-1995《消毒与灭菌效果的评价方法与标准》中推荐使用的压力蒸汽灭菌效果的监测方法。

优点是能够准确监测灭菌温度和时间，缺点是所需时间较长。

建议每个季度用生物指示剂进行高压锅灭菌效果的监测。

定量检测方法（平板法）注意事项

食品微生物学检验可分为定量检验和定性检验两类，其中定量检验又以平板法和MPN法两种最为常见。下面以平板法为例，简单介绍下定量检测中一些常见注意事项，以供大家在日常工作中参考。

1、均质效果对试验结果的影响。均质过程是将样品与稀释液混匀的过程，如果均质效果不好就会使样品中的微生物不能充分混匀到稀释液中，那么试验结果就不能体现样品的真实情况。一般试验数值都小于真实值，目前国标推荐的均质方式是旋转刀均质器的均质杯法和拍击式均质器的均质袋法。大家可以根据自己样品的实际情况进行选择。

2、十倍梯度稀释对试验结果的影响。十倍梯度稀释对定量检测方法的影响是很大的，因为它可以将试验误差成倍的放大。比如10^-1到10^-2稀释时，如果只取了0.98mL，那么到10^-5时，误差就被放大了1000倍。所以在这步操作时一定注意取液量要准确，并且每次稀释后，要将稀释液混合均匀，再进行下一步稀释。

3、平板接种的注意事项。无论是涂布还是倾注接种，都要让微生物分布均匀，且尽量靠近中间，远离边缘，因为菌落生长在边缘时，不容易读取，且易连成片，在涂布时，要在平板中间加入稀释液开始涂布，尽量不要将液体涂布到边缘。在倾注时，也要将稀释液加到平板中间，然后倾注培养基，并轻轻旋转平板，使之混合均匀。

大肠菌群MPN法的常见问题

①试验所依据的标准

首先，查看要求MPN值的单位，是MPN/g还是MPN/100g。如果是MPN/g，按照GB4789.3-2016进行试验；如果是MPN/100g，依据卫生部颁布的通知要求，可以按照GB4789.3―2003进行试验。

②双料的接种和MPN表的检索方法

如果制备的稀释度为10^-1、10^-2、10^-3。其中，10-1取10mL接种于3管双料初发酵培养基中，另取10^-11mL接种于3管单料初发酵培养基中，10^-2取1 mL接种于3管单料初发酵培养基中。完成MPN法的初发酵接种。

最后判定结果时，要依据复发酵的结果来推出初发酵为阳性的管数，再结合初发酵接种的稀释度为1，0.1，0.01。检索MPN表进行判定，注意表内MPN值随稀释度的变化有相应的变化。

③如何判定产气

在MPN法中，初发酵和复发酵阳性管的主要判定依据是产气，但做样品检测时，很多时候大肠菌群的产气量不多，在小导管中很难看到，这时不能直接判定为阴性。轻轻晃动试管，然后将试管倾斜一定角度，如果有大量小气泡从底部升上来，并有逐渐增多的趋势，可判定为阳性。

生化试验可疑菌纯化的目的

致病菌检测过程中，生化试验或者初步筛选以后确证性试验以前，一般要求将可疑菌菌落纯化于特定营养型平板上，比如单增李斯特检验使用TSA-YE进行可疑菌纯化，沙门氏菌和志贺氏菌检测使用营养琼脂进行纯化。可疑菌纯化的目的有如下几点：

一、根据纯化以后的平板上生长的菌落大小及形态，可以判断挑取的可疑菌是不是单独的纯菌落，有没有发生菌落叠加现象。

二、生化试验一般项目较多，选择性分离平板上的可疑菌一般都带有颜色，无法制作菌悬液。生长较小的可疑单菌落无法满足接菌量要求，而且不能保证每个项目接菌量相同。实验结果会有差异。而纯化以后的平板上的所有菌落均来源于同一个单菌落，有大量的菌供生化试验使用。

三、选择性分离平板一般都成分复杂，并且有一定抑制性，其中可能含有某些对个别生化产生影响的物质。而用于纯化的平板都是营养型的，不会对生化项目造成影响。

沙门氏菌检验中血清学试验常见问题

血清学鉴定是沙门氏菌检验中的重要鉴定方法，包括菌体抗原（0）鉴定、鞭毛抗原（H）鉴定和Vi抗原鉴定。由于血清学试验涉及的内容很多，所以我们在此给大家列出几个常见问题，以供大家在日常工作中参考。

1、沙门氏菌判定时以生化试验结果为主还是血清学试验结果为主？

我们在判定时应该以生化试验结果为主，在生化试验的基础上进行血清学判定。有的试验人员会直接用多价血清进行试验，不进行生化试验，这是绝对不可取的。因为血清学的原理是抗原抗体结合，非沙门氏菌的微生物也有可能带有沙门的类似抗原的。所以我们做鉴定的时候，必须先进行生化试验，在生化试验的基础上进行血清学鉴定。

2、血清学试验要做到什么程度？

如果我们只需要鉴定某个菌株是否属于沙门氏菌，那只需要做0多价和H多价血清就可以了。如果需要鉴定某个菌株具体是什么沙门氏菌，比如是否为鼠伤寒沙门氏菌或是否为肠炎沙门氏菌，那就需要进行血清学分型试验，从多价血清一直做到0抗原和H抗原的单因子，然后参照GB4789.4-2016沙门氏菌检验标准中附录B的表格查找对应的沙门菌名。

3、0多价血清不凝集，就一定是0抗原阴性么？

我们在做0多价血清时，如果没有凝集并不能直接判定为阴性，因为我们还要考虑Vi抗原的影响。Vi抗原属于K抗原群，是会阻隔0抗原和相应抗体的结合，所以有Vi抗原存在时，0多价血清是不会凝集的。GB4789.4-2016沙门氏菌检验标准中提到已知具有Vi抗原的菌型有：伤寒沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌和都柏林沙门氏菌。因此，我们必须去除Vi抗原的影响。具体方法是将待检菌做成浓菌液，放入100℃沸水中煮沸15-60分钟，目的是破坏Vi抗原，然后再挑取菌液做0多价血清。如果还是不凝集，才能判定为阴性。

荧光实验结果观察

日常试验中，经常会遇到大肠杆菌需要观察荧光是情况。国标GB 4789.38-2012大肠埃希氏菌计数中第二法（VRBA-MUG计数），GB/T 5750.12-2006 水及水源水中的大肠埃希氏检验，都需要观察荧光，可见荧光结果观察的重要性。

MUG是4-甲基伞形酮-β-D-半乳糖苷的缩写，该物质为β-半乳糖苷酶作用的底物，β-半乳糖苷酶与MUG结合并剪切β-半乳糖苷键，释放荧光显色基团4-甲基伞形酮，在紫外光（入＝366nm）下观察，培养物发出蓝色荧光。

观察荧光的条件：

1）紫外光为366nm波长；

2）在黑暗的环境下观察，有助于更好的观察荧光；

3）紫外灯灯管最好直接照射在待测平板或试管上，无玻璃等物品吸收紫外光。

4）使用空白管、阳性菌、阴性菌做对照。

推荐使用“简易便携式荧光检测灯”，不但具备以上三个要求，而且避免了紫外灯直接照射人的情况，对实验人员有所保护。

空白产荧光原因分析：

1）试管或平血洗涮不干净所致。试管或平血中残留4-甲基伞形酮，会导致空白有荧光。

2）观察荧光的紫外灯不合适。紫外灯波长虽为366nm，但外侧有玻璃灯罩、或者功率太大（瓦数太高、灯过亮）均会影响荧光效果。

3）试管或平血本身原因。有些试管或平血，本身由于质量原因，在紫外灯下自身就带有光亮。使用前，可以先拿几种试管或平血装入蒸馏水，先在紫外灯下观察一下，然后挑取亮度比较暗的容器使用。

建议：

建议做荧光试验时，采用阳性对照菌同时观察，可更简单明了。