流式血液样本制备——献给初学者

展源 0 2023-11-21

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流式血液样本制备

流式血液样本制备——献给初学者

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流式细胞术样品制备分为几个步骤呢？

取材：取手术或活检组织必须具有代表性，如取手术肿瘤组织，必须取瘤细胞生长旺盛部位；组织等标本必须在取材后保持样本的新鲜；一般在室温1 个小时之内处理好样本或及时用固定剂或低温对组织进行保存。
单细胞悬液制备：流式细胞术的检测对象是单细胞悬液。
对细胞的待测生物化学成分进行荧光染色。

在应用流式细胞术中，制备出合格的分散单细胞是流式细胞术样本制备技术中重要的环节，直接影响实验结果。

高质量的样本制备评价标准是什么呢？

细胞数量 ：满足流式检测、分选等实验的需求（不少于10⁷个/ml）；
细胞活性 ：细胞膜被破坏的死细胞会非特异吸附单克隆抗体，若死细胞太多影响实验结果如图1；

图1 细胞活性对结果的影响

抗原表位 ：满足细胞分选、流式检测时特异性标记抗原能被抗体标记；
方法简易：处理方法简单，易于操作。

样本来源有哪些呢？

血液：全血溶血、PBMC(外周血单个核细胞) ；
培养的细胞 ：原代细胞；细胞系（贴壁细胞、悬浮细胞）；
实体组织 ：新鲜组织、石蜡包埋样本；
其他：体液、灌洗液等

不同属性的样本制备过程也不一样，对于刚接触流式实验的新手来说，在样本制备方面肯定有诸多困扰，本篇就血液样本单细胞悬液制备跟大家分享一些心得。

血液样本怎么储存呢？

最常用的抗凝剂：EDTA、肝素

EDTA-K₂:室温储存，不可冻存，12h内处理。

注意事项：

1、EDTA-K₂可使粒细胞脱粒；

2、不适用血小板实验和胞内因子实验。

肝素钠：室温存放，不可冻存，24h内处理。

注意事项:

过量的肝素钠导致白细胞和血小板聚集。

血液细胞成分都有哪些呢？

如图2：

图2 血液组成成分

全血中含有红细胞，白细胞和血小板三种有形成分，通常流式检测是以某一群细胞为测定对象，因此在检测前须将所测的某群细胞分离出来。

那么血液样本各细胞群分别怎么制备呢？一起来看一下吧

红细胞的样本制备

抗凝全血100-2000μL，3500rpm离心7min，从红细胞层中部吸取红细胞10μL，用生理盐水或者PBS稀释至10⁵个/μL；

白细胞的样本制备

溶血法

一倍体积抗凝全血，加入3-5倍体积红细胞裂解液，轻轻涡旋或颠倒均匀；
室温裂红3~5min，其间轻轻混匀2次；
收集细胞：4 ℃，300g离心10min，弃上清；
PBS重悬。

注意事项：

评价裂红效果的标准：溶液应该清澈透亮；
溶血素的工作温度是室温，若血样来源于小鼠或者大鼠工作温度建议升至37℃，适当增加裂红时间；
溶血素工作液需要4℃保存，一个月之内稳定，最好现配现用；
如图3溶血效果好，分群清晰；溶血效果不好分群不清晰。

图3 溶血效果

溶血法操作简单的率高，适用于流式分析，但裂解后红细胞碎片较多，不易去除。
如果细胞活性比较重要或者需要胞内染色实验，建议处理为PBMC(外周血单个核细胞，主要包括淋巴细胞，单核细胞，吞噬细胞，树突状细胞和其他少量细胞类型)。

图4 胞内染色实验溶血和提取PBMC对比

Ficoll法

取全血，使用等量PBS稀释。
取与血稀释液等量的PBS于管底，将血液稀释液小心加至PBS液面上层。（小心不要使两种溶液混合）
离心：800g，30min，离心机自然降速至0，离心完毕将得到如图5示分层；

图5 分层示意图
吸取白膜层至新15mL离心管中。（吸取的时候可以先将上层血浆吸掉方便操作。）
白膜层液体加10~15ml PBS离心，300g，10min，弃上清。沉淀再加PBS清洗一次，弃上清。
沉淀加入正常培养的完全培养基进行培养，2~3小时，使单核细胞贴壁。
镜下观察细胞贴壁后，更换培养基，去除未贴壁细胞，保留下来的即为所需的PBMC。

注意事项：

Ficoll温度比较低时，离心之后白膜层比较分散，建议Ficoll从冰箱中拿出来后，先恢复到室温；
淋巴里有红细胞污染，可能是离心速度不够或者孵育时间太短操作温度太低；
PBMC得率差活性低与操作温度有关；得率差活性正常与配置比例有关；得率低有粒细胞污染与离心没有配平有关。
Ficoll法获取细胞活性高，可用于分选功能实验，但其耗时长需要细致和专业的操作。

血小板样本制备

洗涤法

抗凝全血1500rpm/ 200g离心12min，取上层富血小板血浆3500rpm/1200g离心5min。弃去上层血浆，用血小板洗涤液洗涤3次。

Ficoll法

参考以上提取PBMC的操作，血小板因密度小而悬浮于上层，取上层，用血小板洗涤液洗涤3次。

注意事项：

检测活化血小板表面时，提倡用全血法检测，用血少，方便，快捷，血小板更接近生理状态，不提倡洗涤，因为多步骤离心，洗涤后容易使血小板活化这样就会使检测结果偏高。

内容来源：科享家

责任编辑：展源

审　　核：何发

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