色谱定量方法对比，你选对了吗

赵桂芝 0 2024-01-01

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色谱分析的重要作用之一是对样品进行定量，色谱定量的依据是：组分的重量或浓度与检测器的响应信号成正比。选择合适的定量方法时，除需要考虑相对定量还是绝对定量外，同时也需要考虑化合物的线性响应范围，是否有合适内标、是否有标准品等。今天我们来了解一下色谱是如何定量的。

色谱定量两大依据

以气相色谱为例，气相色谱是用峰面积或者峰高来定量的。依据如下：

1、最重要的第一条，就是检测器的线性响应关系。

在所有的色谱检测器中，除了FPD之外，所有的检测器都遵从线性响应，也就是说m=KS。这里m指单位时间内到达检测器的待测物质的量（包括质量或物质的量），K表示线性响应系数，S表示检测器响应信号的值。也就是说，检测器响应信号的大小与单位时间到达检测器的被测物质的总量成正比。当然我们也知道，这个关系是有范围的，量太大或者太小，都会脱离线性。

2、其次就是第二条，塔板理论。

塔板理论充分阐述了峰高与进样量之间的关系，或者说他们之间是成正比的。这个可以参考对塔板理论的说明。

根据这两条，可以肯定的说待测物质的峰高与待测物的进样总量成正比。或者利用微积分可以推断出待测物质的峰面积和待测物的进样总量成正比。既然峰高和峰面积都与进样总量成正比，为什么我们喜欢用峰面积，而不是更简单的峰高呢？这个问题也很简单，因为塔板理论不完全正确，峰形经常不完全满足正态分布，所以峰高的代表性不足。

什么时候峰高能够有良好的代表性？

很明显，峰形良好而且对称，成良好的正态分布曲线形状的时候，或者说峰形尖锐且对称的时候。

色谱峰经常拖尾，所以用峰面积定量就可以了，峰面积绝大多数情形下都具有很好的代表性。但是在检测器超载，或模数转换器超载，或峰面积积分不准，或进样代表性不足，以及一些其他特殊情形下，用峰面积也不能得到正确结果。但无论如何，用峰面积定量已经是我们可实行的最准确方法了。

色谱定量分析，顾名思义就是色谱分析方法来测定组分的含量，主要分为面积百分比法、归一化法、外标法、内标法和标准加入法，色谱定量分析首先需要明确的概念是响应因子，不同的化合物在检测器的响应是不一样的，简单地举个例子说，相同浓度的化合物A和B，相同的进样量，得到的峰高和峰面积不一定一样的，响应因子的计算式如下：

式中，w为化合物的含量，A为响应值，一般为峰面积或峰高，以峰面积为例。

由于不同的化合物在同一个检测器的响应因子不同，甚至同一个化合物不同浓度在同一检测器的响应因子不同，简单地说就是化合物在检测器的响应不呈线性，或者线性范围比较窄。选择合适的定量方法时，除需要考虑是相对定量还是绝对定量外，同时需要考察化合物的线性响应范围、是否有合适内标、是否有标准品等。接下来小析姐就主要介绍下色谱分析中常用的三种定量方法：面积归一化法、外标法和内标法。

归一化法

由于组分的量与其峰面积成正比，如果样品中所有组分都能产生信号，得到相应的色谱峰，那么可以用如下归一化公式计算各组分的含量。

若样品中各组分的校正因子相近，可将校正因子消去，直接用峰面积归一化进行计算。中国药典用不加校正因子的面积归一化法测定药物中各杂质及杂质的总量限度。

优点：简便、准确、定量结果与进样量重复性无关(在色谱柱不超载的范围内)、操作条件略有变化时对结果影响较小。

缺点：必须所有组分在一个分析周期内都流出色谱柱，而且检测器对它们都产生信号。不适于微量杂质的含量测定。

外标法

用待测组分的纯品作对照物质，以对照物质和样品中待测组分的响应信号相比较进行定量的方法称为外标法。此法可分为工作曲线法及外标一点法等。

工作曲线法是用对照物质配制一系列浓度的对照品溶液确定工作曲线，求出斜率、截距。在完全相同的条件下，准确进样与对照品溶液相同体积的样品溶液，根据待测组分的信号，从标准曲线上查出其浓度，或用回归方程计算，工作曲线法也可以用外标二点法代替。通常截距应为零，若不等于零说明存在系统误差。工作曲线的截距为零时，可用外标一点法(直接比较法)定量。

外标一点法是用一种浓度的对照品溶液对比测定样品溶液中i组分的含量。将对照品溶液与样品溶液在相同条件下多次进样，测得峰面积的平均值，用下式计算样品中i组分的量：

Wi＝AiWs／As

式中Wi与Ai分别代表在样品溶液进样体积中所含i组分的重量及相应的峰面积。Ws及As分别代表在对照品溶液进样体积中含纯品i组分的重量及相应峰面积。

优点：简便，不需用校正因子，不论样品中其他组分是否出峰，均可对待测组分定量。

缺点：此法的准确性受进样重复性和实验条件稳定性的影响。

此外，为了降低外标一点法的实验误差，应尽量使配制的对照品溶液的浓度与样品中组分的浓度相近。

内标法

选择样品中不含有的纯物质作为对照物质加入待测样品溶液中，以待测组分和对照物质的响应信号对比，测定待测组分含量的方法称为内标法。“内标”的由来是因为标准(对照)物质加入到样品中，有别于外标法。该对照物质称为内标物。

在一个分析周期内不是所有组分都能流出色谱柱(如有难气化组分)，或检测器不能对每个组分都产生信号，或只需测定混合物中某几个组分的含量时，可采用内标法。

准确称量W克样品，再准确称量Ws克内标物，加入至样品中，混匀，进样。测量待测组分i的峰面积Ai及内标物的峰面积As，则i组分在W克样品中所含的重量Wi，与内标物的重量Wi，有下述关系：