DNA提取及检测，这些细节你注意到了吗？

展源 0 2024-02-23

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做DNA提取及含量测定，你是否一次成功，有没有遇到过奇怪的问题，一起来看看前辈的经验总结，跟小析姐一起get技能，无惧实验！

DNA提取

制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤,通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素,以保证DNA的完整性,为后续的实验打下基础。主要是CTAB方法,其他的方法有:1、物理方式:玻璃珠法,超声波法,研磨法,冻融法。2、化学方式:异硫氰酸胍法,碱裂解法3、生物方式:酶法。根据核酸分离纯化方式的不同有:硅质材料、阴离子交换树脂等。下面介绍一下本实验室常用的几种方法。

(一)经典DNA提取方法——酚氯提取法:

试验原理:

苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白质的变性剂,反复抽提,使蛋白质变性,SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解,在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子,核蛋白变性降解,使DNA从核蛋白中游离出来。 DNA易溶于水,不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团,也容易进行水合作用,并在表面形成一层水化层,使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时,蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏,变性沉淀。离心后有机溶剂在试管底层(有机相),DNA存在于上层水相中,蛋白质则沉淀于两相之间。酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白质。氯仿的作用是有助于水相与有机相分离和除去DNA溶液中的酚。抽提后的DNA溶液用2倍体积的无水乙醇在1/103mol/LNaCl存在下沉淀DNA,回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉淀中的盐,真空干燥,用TE缓冲液溶解DNA备用。

具体步骤:

取枸橼酸钠抗凝外周血2ml加8ml 1×红细胞裂解液放在15ml离心管中,冰上放置30min,至溶液透明,3000rpm离心10min,去除上清。加1×红细胞裂解液4ml,充分混匀, ,3000rpm离心10min,去除上清,加100μl 20%SDS,加30μl 20mg/ml的蛋白酶k摇匀, 37℃摇床过夜(>8h)。加等体积饱和酚至上述样品处理液中,温和充分混匀,静置10分钟, 离心3000rpm×10min,取上层水相到另一1.5ml离心管中,加等体积饱和酚,混匀,离心3000rpm×10min,取上层水相到另一管中。加等体积酚/氯仿(1:1),轻轻混匀,离心3000rpm×10min,取上层水相到另一管中。如水相仍不澄清,可重复此步骤数次。加等体积氯仿,轻轻混匀,离心3000rpm×10min 。取上层水相到另一管中, 加2倍体积的无水乙醇及少量生理盐水,轻轻倒置混匀。待絮状物出现后,离心12000rpm×10min,弃上清液。沉淀用75%乙醇洗涤,离心12000rpm×10min ,弃上清液。室温下挥发乙醇,待沉淀将近透明后加TE水溶解过夜。 Nanodrop 核酸定量分析仪测定DNA浓度并记录,最后将所提DNA放置-20℃冻存。

(二)真核细胞DNA的制备:

一般真核细胞基因组DNA有107-109bp,可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取,常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞,随后用酚抽提而实现的。这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析,还可用于PCR的模板、文库构建等实验。

根据材料来源不同,采取不同的材料处理方法,而后的DNA提取方法大体类似,但都应考虑以下两个原则:

1、防止和抑制DNase对DNA的降解。

2、尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。

具体步骤:

（1）试剂准备:TE: 10mM Tris-HCl(pH7.8),1mM EDTA (pH8.0),TBS: 25mM Tris-HCl(pH7.4),200mMNaCl;5mMKCl,裂解缓冲液(250mMSDS,使用前加入蛋白酶K至100mg/ml),20%SDS,2mg/ml蛋白酶K,Tris饱和酚(pH8.0),酚/氯仿(酚∶氯仿=1∶1),无水乙醇,75%乙醇。

（2）新鲜或冰冻组织处理:取组织块0.3-0.5cm3(大约100g) 剪碎,加TE 0.5ml,转移到匀浆器中匀浆。将匀浆液转移到1.5ml离心管中。加20%SDS 25ml,蛋白酶K (2mg/ml)25ml,混匀。60°C水浴1-3小时(根据样本的情况可适当增加水浴时间)。

（3）提取DNA: 加等体积饱和酚至上述样品处理液中,充分混匀3min。离心5000g×10min,取上层水相到另一1.5ml离心管中。加等体积饱和酚,混匀,离心5000g×10min,取上层水相到另一管中。加等体积酚/氯仿,轻轻混匀,离心5000g×10min,取上层水相到另一管中。如水相仍不澄清,可重复此步骤数次。加等体积氯仿,轻轻混匀,离心5000g×10min,取上层水相到另一管中。加1/10体积的3M醋酸钠(pH5.2)和2.5倍体积的无水乙醇,轻轻倒置混匀。待絮状物出现后,离心5000g×5min,弃上清液。沉淀用75%乙醇洗涤,离心5000g×3min,弃上清液。室温下挥发乙醇,待沉淀将近透明后加50-100ulTE溶解过夜。

(三)DNA提取试剂盒制备DNA模板

DNA提取试剂盒是适用于PCR研究的快速提取DNA的方法,与经典酚氯提取法相比,高效、快速的提取纯度较高的DNA,操作过程简单,无毒无味,所需样品材料的量较少;但价格较为昂贵,且产出DNA的量少。现今全血DNA提取试剂盒、细胞及组织DNA提取试剂盒等均已商品化,可在TIANGEN, 宝生物、QIAGEN等生物公司购买,其具体实验步骤参照试剂盒中提供的说明书操作,下面以唾液中DNA的制备为例,介绍DNA提取试剂盒(QIAamp Blood DNA Mini Kit)的使用步骤。

具体步骤:

1、0.5 mL唾液以1 mL PBS缓冲液(pH 7.4)重悬,3000g离心5分钟,弃上清;

2、沉淀以200ml PBS缓冲液和20ml Protease重悬后,按QIAamp DNA Kit试剂盒使用要求制备DNA(洗脱体积50ml):加入200mL 裂解液AL,涡悬混合器处理15秒, 56℃ 水浴10min,离心机上甩一下, 加入200mL 无水乙醇,混匀, 转入spin cloumn中, 6000g离心 1min, 弃滤出液,柱子中加入500ml AW1, 6000g 离心1min, 弃滤出液,加入500ml AW2, 20000g 离心3min, 弃滤出液, 将柱子中溶液置于新1.5ml EP管中,加入50ul AE,室温或56℃静置1-3min, 再次6000g 离心1min 收获DNA。

DNA含量及纯度的检测

实验原理:

一种方法是通过凝胶电泳的方法检测DNA的含量:取2-5μlDNA溶解液与0. 4μl 6×载样缓冲液混合,用0.75%琼脂糖凝胶(含EB0.5μg/ml)检测。 溴化乙锭可迅速嵌于DNA双螺旋结构中,嵌入DNA中的溴化乙锭受紫外光激发而发出荧光,这种荧光强度与DNA总质量数成正比,通过比较样品与标准品的荧光强度,对样品中的DNA进行定量。(详见凝胶电泳)

另一方法是分光光度法,组成DNA的碱基,具有一定的吸收紫外线的特性,其最大吸收值在波长250-270nm之间。 这些碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后,其吸收紫外线的特性没有改变,核酸的最大吸收波长为260nm,利用DNA的这个物理特性来测定DNA的浓度。同时可以检测280nm处紫外吸收值,当OD260/OD280的值在1.8-2.0之间时DNA纯度较好,排除蛋白等的污染,可用于PCR等DNA质量要求较高的实验。

分光光度法的具体方法是