WB出现杂带怎么办

张明 0 2024-05-23

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WB实验曝光显出多个条带，蛋白大小跟报道的分子量不一致，是不是非特异带？

“出现杂带”以及“条带位置不符合预期”，这两种情况需要分开讨论：

第一种情况： 蛋白转录及翻译后的修饰，该因素是引起杂带的最常见原因。

转录后，由于选择性剪切的作用，同一个转录本会翻译出不同大小的蛋白，这类蛋白称为该蛋白的剪接体。

在UniProt查询蛋白时，可以在“Sequences ”部分看到该蛋白已报道过的Isoforms。在进行实验前，需要比对每个剪接体造成的变化是否影响了目标蛋白的对应结构域，进而判断本研究种涉及的蛋白到底应该检测哪条主带，又或者哪几条带。

我们在阅读文献时所看到的WB实验图片中，也偶尔会出现双条带或多条带。 这些现象是研究过程中值得解释和讨论的。在进行Western Blot实验时，我们应该清楚，针对某些目标蛋白的检测结果并不一定是只有一条带。

此外，蛋白在翻译完成后， 可能会进行各类修饰， 引起蛋白大小明显改变的多为糖基化修饰。在一些分泌型蛋白和膜蛋白上，糖基化位点的存在会将一个蛋白的大小增加至两倍或者更多，且由于组织的特异性，同一个蛋白在不同样本中的糖基化修饰差别很大。

同时，有的蛋白存在前体和成熟体，这种蛋白一般在研究时，应该会有所了解，但为了防止信息差，依然需要跟客户解释这个蛋白本身的特性。

第二种情况比较偶发： 在细胞的培养状态不太好或细胞传代过多的情况下，由于基因组的变异，细胞会表达某种蛋白的截短蛋白。这种被截短、剪接后的靶蛋白可能是未经报道，但由于仍存在抗原识别位点（或抗原表位）而被识别出来。一般情况下，可以通过裁膜避免。

还有一各影响因素，即蛋白等电点。

蛋白质本身是有电荷的， 当处于某一个pH值时，蛋白质电荷会被中和， 那么该处的数值我们称为等电点pI。大部分的蛋白质的等电点小于6，所以我们在中性的电泳环境中，蛋白因为等电点小于pH值，因此带负电荷，而电泳是蛋白从负极向正极迁移的过程，带负电的蛋白在电场中，不会受到阻力。

但是有的蛋白等电点比较大， 大于7甚至接近8， 这时，由于电泳条件不足以中和电荷，使得蛋白质带正电，在电场中迁移受到阻力，由此产生蛋白分子量变大的错觉，因此marker仅能作为参考，而实际的主带仍然要结合蛋白特性进行判断。

样本保存和冻融。反复的冻融，或者蛋白酶抑制剂，磷酸酶抑制剂失效，会造成蛋白质的降解，引起多条带的情况出现，但这种情况一般是以“拖尾”的形式居多。

另一种情况， 大分子的蛋白本身会发生降解， 但是由于观测的条带在比较大的marker附近，降解的较小片段在实际裁膜过程中，基本检测不到。同时，煮沸蛋白的时间不够，冻融后没有煮，会造成蛋白形成同源多聚体的形式，在目的大小两倍，或者多倍的地方出现条带。

内容来源：生物耗材试剂圈

责任编辑：展源

审　　核：何发