HPLC流动相的十个错误操作，看看你中了几招？

赵桂芝 0 2024-10-29

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流动相

高效液相色谱法（HPLC）是分析化学中广泛使用的一种技术，用于分离、鉴定和量化混合物中的成分。高效液相色谱分离的成功与否在很大程度上取决于流动相的特性，流动相是流经固定相的液体溶剂。应根据分析物的化学性质和所用固定相的性质仔细选择流动相。

本文将讨论高效液相色谱中的流动相，包括其定义、类型、特性、选择标准和优化技术。

定义：流动相是流经高效液相色谱柱固定相的液体溶剂，携带着分析物。流动相有两个主要作用：一是溶解样品成分并将其带入固定相；二是与固定相相互作用，促进分析物的分离。

类型：高效液相色谱法使用的流动相可分为两大类：水性流动相和非水性流动相。水性流动相的主要成分是水，而非水性流动相不含水。

水性流动相：高效液相色谱分离通常使用水性流动相，因为水性流动相能有效溶解多种分析物，而且价格通常低于非水性溶剂。最常见的水性流动相是水与甲醇或乙腈等有机试剂的混合物。有机改性剂的选择取决于所分离分析物的性质和所使用的固定相。

非水性流动相：当被分离的分析物不溶于水或水会干扰分离时，就会使用非水性流动相。非水性流动相包括二氯甲烷、四氢呋喃和正己烷等溶剂。这些溶剂通常与甲醇或乙腈等极性溶剂结合使用，以提高分离效率。

流动相的特性：流动相的特性对高效液相色谱分离至关重要，因为它们会极大地影响分离效率和选择性。流动相最重要的特性包括极性、粘度、pH 值和离子强度。

极性：流动相的极性是高效液相色谱分离的关键因素，因为它决定了分析物与固定相之间相互作用的强度。极性流动相适用于分离极性化合物，而非极性流动相则是分离非极性化合物的理想选择。可以通过改变水性流动相中有机改性剂与水的比例来调节流动相的极性。

粘度：粘度是流动相的另一个关键属性，因为它会影响流动相通过色谱柱所需的流速和压力。流动相的粘度可通过改变溶剂成分、温度或压力来调节。

pH：流动相的 pH 值在高效液相色谱分离中非常重要，因为它会影响分析物和固定相的电离状态。流动相的 pH 值应根据被分离分析物和所用固定相的 pKa 值进行调节。例如，碱性流动相适合分离酸性化合物，而酸性流动相则适合分离碱性化合物。

离子强度：流动相的离子强度是指溶液中离子的浓度，它通过改变分析物与固定相之间的静电相互作用来影响分离效率。流动相的离子强度可通过改变溶液中盐或缓冲液的浓度来调节。

流动相的选择标准：流动相的选择在高效液相色谱分离中至关重要，取决于多个因素，包括分析物的化学性质、固定相和分离目标。

流动相的优化：流动相的优化在高效液相色谱分离中至关重要，因为它能显著影响分离效率和选择性。流动相的优化包括调整流动相的特性，以达到理想的分离效果。

流动相相当于液相的血液，在使用过程中会有各种需要注意的事项。其中有些“坑”千万要注意。

加入有机溶剂之后测量移动相酸碱度

如果你用有机添加剂测量pH值，得到的pH值会与添加有机溶剂之前的值不同。然而，最重要的一点是要保持一致。如果你总是在加入有机溶剂之后测量pH值，那么务必保证在使用的方法中陈述你的步骤，这样的话其他人就会按照统一方式进行。这种方式并不保证百分百准确，但是至少可以保持方法的前后统一。这也许会比得到精准的pH值更加重要。

没有使用缓冲液

缓冲剂的作用就是用来控制PH值并阻止其发生变化。很多其他方法会改变流动相的PH值，会引起停留时间、峰形以及峰值响应的漂移。

甲酸、TFA等不是缓冲剂

没有在正常酸碱度范围内使用缓冲液

每个缓冲盐有2个pH单位范围宽度，在这个范围内可以提供稳定性最佳的pH值。窗口之外的缓冲盐不具备有效的抗pH值变化能力。要么在正确的范围内使用缓冲剂，要么选择一种缓冲剂可以涵盖你所需要的pH值。

向有机溶液中加缓冲液

将缓冲溶液与有机相混合，会极有可能引起缓冲液沉淀。在很多情况下，即使沉淀现象已经发生了，但仍很难被发现。记住，一定要将有机溶液加入到水相当中，这可以很好的降低缓冲液沉淀的几率。

从0%用泵混合浓度梯度

现在使用的泵可以有效的混合流动相并实现在线脱气，但并不是使用你的方法的任何人都会配有高质量的泵。将A和B混合到一个单独的溶液中，在100%线上运行。

比如说通过用50ml水混合制备有机950ml起始混合物。这样做的好处就是可以减少HPLC之间的可变性，减少系统中产生气泡和沉淀的可能性。值得注意的是泵混合液的比例是95:5并不代表瓶体的预混合保留时间也为95:5。

不要使用正确的改性酸（碱）改变缓冲液

只能使用形成你使用的缓冲盐的酸或碱。比如磷酸钠缓冲液应仅用磷酸或氢氧化钠调节。

没有在方法中阐述有关缓冲液的全部信息，比如说在1000ml的水中加入5g磷酸钠。

缓冲剂的类型决定了能够缓冲的PH范围。所需的浓度决定了缓冲强度。5克或无水磷酸钠和5克一水合物磷酸一钠具有不同的缓冲强度。

0还没先检查就开始溶剂

如果上一个方法中基线B中使用过的是缓冲液，而你的方法中，基线B使用的是有机溶液，好在你可以沉淀泵管和泵头中的缓冲剂。

支起瓶体清空最后一滴

很有可能你没有足够的流动相完成整个操作，最后样品会冒烟的。除了可能存在烧干泵系统和柱子的可能性之外，流动相也会蒸发的一干二净，瓶体顶部的流动相会发生变化。

利用超声脱气的流动相

最重要的一点就是确保所有的缓冲盐已经溶解，但是这是一种效果最差的脱气方式，并且它会很快让流动相升温，从而引起有机成分蒸发掉。为了省去之后不必要的麻烦，请用五分钟时间使用真空过滤你的流动相。

内容来源：仪器小知识药物分析之家

责任编辑：展源

审　　核：何发

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