【收藏】一文了解色谱知识

张明 0 2024-10-31

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色谱法是一种分析化学物质的技术。色谱法的字面意思是颜色书写，指的是将待分析物质倒入装有吸附剂的垂直玻璃管中，物质的各种成分根据对吸附剂的吸引程度以不同的速度通过吸附剂，并在吸附柱的不同位置产生色带的方法。该术语已扩展到包括利用相同原理的其他方法，尽管在吸附柱中不会产生颜色。

色谱法中的流动相是指携带样品中的物质通过吸附材料的流体。固定相（或吸附剂）是指吸附通过它的固体材料。高岭土、氧化铝、硅胶和活性炭都曾被用作吸附物质或固定相。

色谱法的分离原理

当混合物随流动相流经色谱柱时，就会与柱中固定相发生作用(溶解、吸附等)，由于混合物中各组分物理化学性质和结构上的差异，与固定相发生作用的大小、强弱不同，在同一推动力作用下，各组分在固定相中的滞留时间不同，从而使混合物中各组分按一定顺序从柱中流出。这种利用各组分在两相中性能上的差异，使混合物中各组分分离的技术，称为色谱法。

流动相

色谱分离过程中携带组分向前移动的物质。

固定相

色谱分离过程中不移动的具有吸附活性的固体或是涂渍在载体表面的液体。

色谱法有啥特点？

(1)分离效率高，复杂混合物，有机同系物、异构体。

(2)灵敏度高，可以检测出μg.g^-¹(10^-6)级甚至ng.g^-1(10^-9)级的物质量。

(3)分析速度快，一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。

(4)应用范围广，气相色谱：沸点低于400℃的各种有机或无机试样的分析。液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析。

(5)高选择性：对性质极为相似的组分有很强的分离能力。

特点可以简记为：三高一快一广。

如何分类？

按两相状态分类，按操作形式分类，按分离原理分类。

（1）按两相状态分类

气相色谱(Gas Chromatography, GC)，液相色谱(Liquid Chromatography, LC)，超临界流体色谱 (Supercritical Fluid Chromatography, SFC)。

气相色谱：流动相为气体(称为载气)。常用的气相色谱流动相有N₂、H₂、He等气体，按分离柱不同可分为：填充柱色谱和毛细管柱色谱；按固定相的不同又分为：气固色谱和气液色谱。

液相色谱：流动相为液体(也称为淋洗液)。按固定相的不同分为：液固色谱和液液色谱。

超临界流体色谱：流动相为超临界流体。超临界流体是一种介于气体和液体之间的状态。超临界流体色谱法是集气相色谱法和液相色谱法的优势而发展起来的一种新型的色谱分离分析技术，不仅能够分析气相色谱不宜分析的高沸点、低挥发性的试样组分，而且具有比高效液相色谱更快的分析速率和更高的柱效率。

（2）按操作形式分类

柱色谱(Column Chromatography, CC)固定相装在柱管内；包括填充柱色谱和毛细管柱色谱。

纸色谱(Paper Chromatography, PC)固定相为滤纸；采用适当溶剂使样品在滤纸上展开而进行分离。

薄层色谱(Thin Layer Chromatography, TLC)固定相压成或涂成薄层；操作方法同纸色谱。

（3）按分离原理分类

吸附色谱(Absorption chromatography)；分配色谱(Partition Chromatography)；离子交换色谱(Ion Exchange Chromatography)；凝胶色谱(Gel Chromatography)。

分支

色谱法分为气相、液相和超临界流体技术。气相色谱法又分为气-液技术和气-固技术。

液相色谱法分为薄层色谱法等相对较多的技术。加压液相色谱法又可分为离子交换色谱法、排阻色谱法、分配色谱法和液固色谱法。

组成

系统的核心是进行分离的色谱柱。

溶剂储液器：玻璃储液器中含有流动相内容物。高效液相色谱法中的流动相或溶剂通常是极性和非极性液体成分的混合物，其各自的浓度根据样品的成分而变化。
泵：泵将流动相从溶剂储液器中吸出，并迫使其通过系统的色谱柱和检测器。根据色谱柱的尺寸、固定相的粒度、流速和流动相的成分等因素，工作压力最高可达 42000 kPa（约 6000 psi）。
样品进样器：进样器可以是单次进样，也可以是自动进样系统。用于高效液相色谱系统的进样器应能在高压（高达 4000 psi）条件下对体积在 0.1-100 mL 范围内的液体样品进行进样，并具有较高的重现性。
色谱柱：色谱柱通常由抛光不锈钢制成，长度在 50 至 300 毫米之间，内径在 2 至 5 毫米之间。色谱柱通常填充粒径为 3-10 微米的固定相。内径小于 2 毫米的色谱柱通常称为微孔色谱柱。理想情况下，流动相和色谱柱的温度在分析过程中应保持恒定。
检测器：高效液相色谱检测器位于色谱柱的末端，在分析物从色谱柱洗脱出来时对其进行检测。常用的检测器有紫外光谱检测器、荧光检测器、质谱检测器和电化学检测器。
数据收集装置：检测器发出的信号可收集到图表记录器或电子积分器上，它们的复杂程度和处理、存储和再处理色谱数据的能力各不相同。计算机将检测器对每种成分的响应进行整合，并将其放入色谱仪中，以便于读取和解释。

色谱图

组分在检测器上产生的信号强度对时间(t)所作的图，由于它记录了各组分流出色谱柱的情况，所以又叫色谱流出曲线。流出曲线的突起部分称为色谱峰。

（1）色谱保留值

色谱保留值是色谱定性分析的依据，它体现了各待测组分在色谱柱上的滞留况。在固定相中溶解性能越好，或与固定相的吸附性能越强的组分，在柱中的滞留时间越长，或者说将组分带出色谱柱所需的流动相体积越大。所以保留值可以用保留时间和保留体积两套参数来描述。

（2）色谱图上的色谱流出曲线可以说明什么问题

根据色谱峰的数目，可判断样品中所含组分的最少个数；根据色谱峰的保留值进行定性分析；根据色谱峰的面积或峰高进行定量分析；根据色谱峰的保留值和区域宽度评价色谱柱的分离效能；根据两峰间的距离，可评价固定相及流动相选择是否合适。

（3）组分保留时间为何不同?色谱峰为何变宽?
组分保留时间：色谱过程的热力学因素控制；(组分和固定液的结构和性质)。色谱峰变宽：色谱过程的动力学因素控制；(两相中的运动阻力，扩散作用)。塔板理论和速率理论分别从热力学和动力学的角度阐述了色谱分离效能及其影响因素。

分配系数

分配比是指在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的质量比。

分配系数

在色谱流出曲线上，两峰之间的距离主要由两组分在两相间的分配系数还是扩散速度决定?为什么?

答：分配系数。两峰间的距离由热力学因素决定，两组分在两相中分配系数差异越大，两峰间的距离则相差越大，越容易被分离。而扩散速度是动力学因素，反映在色谱流出曲线上即为色谱峰的区域宽度(形状)。

塔板理论和速率理论

（1）塔板理论的特点
塔板理论引入了塔板数和塔板高度作为柱效的衡量指标；不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质；柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数K相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。

（2）塔板理论的优点和不足
优点：从热力学角度解释了色谱流出曲线的形状和浓度极大点的位置，阐明了保留值与k的关系，提出了评价柱校高低的n和H的计算式；

不足：塔板理论的基本假设不符合色谱柱的实际分离过程。塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的流动相流速下柱效不同的实验结果，不能说明色谱峰为什么会展宽，同时未能指出影响柱效的因素及提高柱效的途径和方法。

（3）速率方程
(也称范第姆特方程式)：H = A + B/u + C·u ， H：塔板高度; u：流动相的平均线速度(cm/s)。

A——涡流扩散项：A与流动相性质、流动相速率无关。要减小A值，需要从提高固定相的颗粒细度和均匀性以及填充均匀性来解决。对于空心毛细管柱，A=0。固定相颗粒越小dp↓，填充的越均匀，A↓，H↓，柱效n↑。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。

B/u——分子扩散项：存在着浓度差，产生纵向扩散;扩散导致色谱峰变宽，H↑(n↓)，分离变差；分子扩散项与流速有关，流速↓，滞留时间↑，扩散↑；扩散系数：Dg ∝(M载气)-1/2；M载气↑，B值↓。

C ·u——传质阻力项：dp↓， df↓, D ↑，可降低传质阻力。

（4）H-u 曲线与最佳流速

由于流速对这两项完全相反的作用，流速对柱效的总影响使得存在着一个最佳流速值，即速率方程式中塔板高度对流速的一阶导数有一极小值。以塔板高度H对应流速u作图，曲线最低点的流速即为最佳流速。

（5）速率理论的要点

组分分子在柱内运行的多路径与涡流扩散、浓度梯度所造成的分子扩散及传质阻力使两相间的分配平衡不能瞬间达到等因素是造成色谱峰扩展、柱效下降的主要原因；通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载气流速可提高柱效；速率理论为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响；各种因素相互制约，如载气流速增大，分子扩散项的影响减小，使柱效提高，但同时传质阻力项的影响增大，又使柱效下降;柱温升高，有利于传质，但又加剧了分子扩散的影响。选择最佳条件，才能使柱效达到最高。