【干货】一文搞懂活性氧ROS检测实验！

张明 0 2024-12-30

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目前常用于检测活性氧物种（ROS）的方法包括电子顺磁共振技术、荧光染色法、化学发光法、色谱方法、分光光度法、电化学生物传感器以及基于荧光蛋白的方法。在这些方法中，DCFH-DA荧光探针法和流式细胞术被广泛使用用于检测ROS的活性水平。下面具体介绍常用的DCFH-DA荧光探针法和流式细胞术检测活性氧ROS。

一、DCFH-DA荧光探针法-具体步骤

1.细胞收集：根据不同的细胞类型选择合适的细胞培养板进行接种和培养，处理完毕后收集细胞（悬浮细胞可直接进行离心）。

2.阳性对照（可选）：将阳性对照样品稀释为1:1000，提前30~60分钟加入培养基中，于37°C避光条件下孵育。

3.工作液配制：将DCFDA工作液以1:1000稀释于无血清细胞培养基或缓冲液（例如PBS）中。

4.细胞染色：先用PBS洗涤细胞以去除细胞内药物残留，然后加入稀释后的探针，在37°C的细胞培养箱内避光孵育30分钟。

5.细胞清洗：使用无血清细胞培养基对细胞进行1-2次洗涤，确保完全去除未进入细胞内的染料。

6.ROS检测：通过流式细胞仪的FL1或BL1通道，在488nm激发下测定530nm的发射信号。DCF的荧光光谱与FITC非常相似，可以使用FITC的参数设置来检测DCF。根据检测结果，细胞可分为两个亚群：ROS阴性细胞荧光强度较低，而ROS阳性细胞则显示较强的绿色荧光。

二、DCFH-DA荧光探针法-注意事项

1.装载探针:
① 首先将无血清培养基中的阳性对照物（Rosup,100mM）稀释至常用工作浓度100μM。对于刺激时间较短的细胞，应先进行探针装载，然后再用活性氧阳性对照物（Rosup）或目标药物刺激细胞。

② 对于刺激时间较长的细胞，应先使用活性氧阳性对照物（Rosup）或目标药物刺激细胞，然后再进行探针装载。

③ 探针一旦被装载，务必清洗掉未进入细胞内的残余探针，否则可能导致背景信号较高。

④ 在完成探针装载并清洗残余探针后，可进行激发波长和发射波长的扫描，以确认探针的装载情况是否良好。

2.检测:
①采用原位装载探针法：可通过激光共聚焦显微镜直接观察，或在收集细胞后利用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪进行检测。

②收集细胞后进行探针装载：使用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪进行检测，亦可直接观察激光共聚焦显微镜。

③建议尽量缩短探针装载后到测定之间的时间（刺激时间除外），以减少各种潜在误差的影响。

三、流式细胞术检测活性氧-具体步骤

①处理细胞：首先，将细胞在含有完全培养基的6cm培养皿中以37°C和5%CO₂的条件培养，直至细胞覆盖率达到70-90%。接着，使用ROS清除剂NAC或H2O2处理细胞。NAC是半胱氨酸和谷胱甘肽的前体，是一种强抗氧化剂。而H2O₂是一种具有氧-氧单键的强氧化剂。

②阳性对照：首先用预热的DPBS洗涤细胞3次，然后将其与新鲜制备的0.1mM H2O₂（来源于DPBS中的1M储备液）一起在37℃下孵育20分钟。
阴性对照：细胞同样用预热的DPBS洗涤3次，然后将其与新鲜制备的5mM NAC在培养基中于37°C孵育1小时。

③配制工作液：需将H2DCFDA储备溶液稀释至DPBS中制成0.1μM的工作溶液。

④收集细胞：通过胰蛋白酶消化，收集细胞并将其以1x106细胞/ml的密度悬浮在工作溶液中，然后在37°C下避光孵育30分钟。随后，将试管以130xg离心5分钟，去除上清液，并轻轻将细胞重悬在预热的DPBS中，重复洗涤两次。

⑤ROS检测：最后，使用488nm激发光源，通过535nm通道进行活性氧的检测。

四、流式细胞术检测活性氧-数据分析

①圈定细胞群:在进行细胞分析时，我们会根据细胞的大小和颗粒度来进行分类。在流式细胞仪中，通常会使用X轴来表示前向散射(FSC)与细胞的尺寸相关联，而Y轴则表示侧向散射(SSC)与细胞内成分相关联。Gate1则是用来圈定需要进行主要细胞群分析的区域。这一步骤有助于我们准确地选择需要进行活性氧水平检测的细胞种群。

②流式细胞术数据分析中，我们首先要对Gate1门内的细胞进行H2DCFDA信号强度的显示。这通常通过生成H2DCFDA直方图来实现。直方图清晰地展示了不同H2DCFDA信号强度水平对应的细胞数量分布。在图中，X轴表示H2DCFDA信号强度，Y轴则表示在对应信号强度上的细胞数量。通过分析直方图，我们可以有效地评估活性氧水平的变化以及细胞内氧化应激的程度。这一步骤对于深入了解活性氧生成的情况至关重要。

五、常见溶液配置

1.DPBS(1L)
①8 g Sodium Chloride(NaCl)
②0.2 g Potassium Chloride(KCl)
③0.2 g Potassium Phosphate,monobasic (KH2PO4)
④1.15 g Sodium Phosphate,dibasic(Na2HPO4)调整pH=7.3

2.H2DCFDA储备液(10mM)
①将10mg溶于2.05ml DMF,制成10mM储备液。
② 分装后存储于-20℃。
③避光和反复冻融。

3.NAC储备液(1M)
①将1g溶于6.128ml蒸馏水制成1M储备液。
②过滤,分装保存于-20℃。
③避光和反复冻融。

4.H2O2储备液(1M)
取50 微升 35%的H₂O₂(约11.6M)加入到530微升无菌去离子水中，制成1M的储备液。

内容来源：科研观

责任编辑：展源

审　　核：何发