原理
【干货】使用分光光度计必备的基础知识
【干货】使用分光光度计必备的基础知识
分光光度法是指应用分光光度计的分析方法，因其具有灵敏、准确、快速及选择性好等特点被广泛应用于实验室的元素分析，分光光度计的使用虽然简单，但是其原理及一些基础知识想必有许多小伙伴也是不了解的，今天小析姐整理了一部分分享给大家，希望能对你有所帮助。
当光束照射到物质上时，光与物质发生相互作用，产生反射、散射、吸收或透射。若被照射的是均匀溶液，光的散射可以忽略。
当一束白光通过某一有色溶液时，一些波长的光被溶液 吸收 ，另一些波长的光则透过溶液。透射光或反射光刺激人眼使人感到颜色的存在。人把自身能感觉到的光定义为可见光。在可见光区，不同波长的光呈现不同的颜色，因此溶液的颜色由透射光的 波长 所决定。透射光与吸收光可组成白光，故称这两种光互为补色光，两种颜色互为补色。
当一束光照射到某物质或其溶液时，组成该物质的分子、原子或离子与光子发生“碰撞”，光子的能量就转移到分子、原子或离子上，是这些粒子由最低能态（基态）跃迁到较高能态（激发态），这个作用称为物质对光的吸收。
被激发的粒子约在10-8s后回到基态，并以热或荧光等形式释放出能量。分子、原子或离子具有 不连续的 量子化能级，仅当照射光光子的能量hυ，与被照射物质粒子的基态和激发态能量之差 相当 时，才能发生吸收。不同物质微粒由于结构不同而具有不同的量子化能级，其基态和激发态能量差也不相同。所以物质对光的吸收具有 选择性 。
吸收曲线，也称为吸收光谱，描述了物质对不同波长的光的吸收能力。将不同波长的光透过某一固定浓度和厚度的有色溶液，测量每一波长下有色溶液对光的吸收程度（即吸光度），然后以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标作图，绘制的曲线即为吸收曲线。
不同浓度的同一物质，在吸收峰附近的吸光度随着浓度 增加而增大 ，但最大吸收波长不变。若在最大吸收波长处测定吸光度，则灵敏度最高。因此， 吸收曲线 是分光光度法中选择测定波长的重要依据。
即朗伯-比尔定律：
当一束平行 单色光 通过液层厚度为b的有色溶液时，溶质吸收了光能，光的强度就要减弱。溶液的浓度越大，通过的液层厚度越大，入射光越强，则光被吸收的越多，光强度的减弱也越显著。该定律是紫外可见分光光度法等各类吸光光度法定量分析的依据，是由实验观察得到的，不仅适用于溶液，也适用于其他均匀非散射的吸光物质。
A=lg(I/I0)=εbc
A-吸光度；
I0-入射光强度，cd；
I-透射光强度，cd；
ε-吸光系数，L/(mol˙cm)；
b-液层厚度（光程长度），cm；
c-有色溶液的浓度，mol/L。
其物理意义为：当一束平行单色光通过 单一均匀 、非散射的吸光物质溶液时，溶液的 吸光度 与溶液浓度和液层厚度的乘积成正比。
式中ε是吸光物质在特定波长和溶剂的情况下的一个特征常数，数值上等于浓度为1mol/L的吸光物质在1cm光程中的吸光度。ε是吸光物质吸光能力的量度，ε值越大，方法的灵敏度越高。由实验结果计算ε时，常以被测物质的总浓度代替吸光物质的浓度，实际上时表观摩尔吸光系数。
T=I/I0
因此：A=lg(1/T)
主要部件
在测量吸光度时，要求光源发出所需波长范围内的连续光谱，要具有足够的光强度，并在一定时间内能保持稳定。
在可见光区测量时，通常使用钨丝灯作为光源。钨丝加热到白炽状态时会发出波长在320~2500nm之间的连续光谱。钨丝灯工作温度一般为2600~2870K，熔点为3680K。钨丝灯的温度决定于电源电压，电源电压的微小波动会引起钨灯光强度的很大变化，因此必须使用稳压电源。
在紫外区测量时，常采用 氢灯或氘灯 产生波长在180~375nm之间的连续光谱作为光源。其理想光源应具有覆盖整个紫外可见光区的连续辐射，强度应比较高，且随波长变化能量变化不大，但在实际上难以实现。氘灯辐射强度比氢灯高2~3倍，寿命也比较长。氙灯的强度一般高于氢灯，但欠稳定，波长范围180~1000nm，常用作荧光分光光度计的激发光源。
单色器是将光源发射的复合光分解为单色光的装置。
一般由5部分组成：入光狭缝、准光气（一般由透镜或凹面反光镜使入射光成为平行光束）、色散器、投影器（一般由一个透镜或凹面镜将分光后的单色光投影至出光狭缝）、出光狭缝。
色散器是 单色器 的核心部分，常用的色散元件是 棱镜或光栅 。
棱镜由 玻璃或石英 制成，玻璃棱镜色散能力强，但吸收紫外光，只能用于350-820nm波长的分析测定，在紫外区必须用 石英 棱镜。
光栅的特点是：色散均匀，呈线性，光度测量便于自动化，工作波段广。
也称为比色皿，是盛放样品溶液的容器，具有两个互相平行、透光且具有精确厚度的平面。
玻璃吸收池光程长度一般为1cm，也有0.1-10cm的。
由于吸收池厚度存在一定误差，其材质对光不是完全透明，在做定量分析时，对吸收池应做配套性试验，试验后标记出放置方向。
紫外光区数值不跳为石英。
检测系统包括检测器和记录显示装置。
检测器是一种光电转换设备，将 光强度转变为电信号 显示出来。
常用的检测器有光电池、光电倍增管和光二极管阵列检测器等。
光电池的光电流较大，不用放大，用于初级的分光光度计上， 疲劳效应 严重。
光电倍增管利用二次电子发射来放大光电流，放大倍数可高达108倍，应用最为广泛。
光二极管阵列检测器由于全部波长同时被检测，扫描速度快，可在0.1s内完成对190-800nm波长范围的扫描。
记录显示装置包括放大器和结果显示装置。70年代采用数字读出装置。现代在主机中装备有微处理机或外接微型计算机，控制仪器操作和处理测量数据，装有屏幕显示、打印机和绘图仪等。
测量条件的选择
进行比色分析或光度分析时，首先要把待测组分转变成有色化合物，然后进行比色或光度测定。
将待测组分转变成有色化合物的反应叫显色反应，与待测组分形成有色化合物的试剂称为显色剂。
显色反应分两类，即络合反应和氧化还原反应，络合反应是最主要的显色反应。
选用的原则是：
选择灵敏的显色反应。 摩尔吸光系数ε 的大小是显色反应灵敏度高低的重要标志，因此应当选择生成的有色物质的ε较大的显色反应。一般来说，当ε为104-105时，可认为该反应灵敏度较高。
尽可能选择选择性好的显色剂。即显色剂仅与一个组分或少数几个组分发生显色反应。
吸光光度法测定的是显色反应达到平衡后溶液的吸光度，因此要得到准确的结果，必须从研究平衡着手，了解影响显色反应的因素，控制适当的条件，使显色反应完全和稳定。
根据溶液平衡原理，有色络合物的稳定常数越大，显色剂过量越多，越有利于待测组分形成有色络合物。但是过量显色剂的加入有时会引起副反应，对测定反而不利。
干扰的消除
光度分析中，共存离子如本身有颜色，或与显色剂作用生成有色化合物，都将干扰测定。
a.干扰离子本身有颜色
b.干扰离子本身无颜色，但能与显色剂反应生成稳定的配合物。若生成的配合物有色则直接干扰测定，若生成的配合物无色，也降低了显色剂的浓度，影响被测离子与显色剂的反应，而产生误差。
c.干扰离子与被测离子反应生成配合物或沉淀，影响被测离子的测定。
a.控制溶液酸度。
b.加入掩蔽剂与干扰离子形成更稳定的化合物，使干扰离子不再产生干扰。
c.里用参比溶液消除某些有色干扰离子的影响。
d.选择适当的工作波长以消除干扰。
e.采用适当的分离方法。
吸光度测量条件的选择
应根据吸收光谱曲线，选择溶液具有 最大吸收时 的波长作为入射光的波长。如显色剂与钴络合物在420nm波长处均有最大吸收峰。如用此波长测定钴，则未反应的显色剂会造成干扰而降低测定的准确度。因此必须选择在 500nm波长处 测定，在此波长下显色剂不发生吸收。而钴络合物则有一吸收平台。
（1）如果仅待测物与显色剂的反应产物有吸收，可用 纯溶剂 作参比溶液。
（2）如果显色剂或其他试剂略有吸收，应用 空白溶液 （不加试样的溶液）作参比溶液。
（3）如试样中其他组分有吸收，但不与显色剂反应，则当显色剂无吸收时，可用试样溶液作参比溶液，当显色剂略有吸收时，可在试液中加入适当掩蔽剂将待测组分掩蔽后再加显色剂，以此溶液作参比溶液。
实践证明，吸光度在 0.2-0.5内 时，测量的相对误差最小。
可用两种方法来调整被测溶液的吸光度：
（1）控制被测溶液的浓度。如改变取样量，改变溶液的浓缩倍数或稀释倍数。
（2）选择不同的比色皿。吸光度小的溶液要用光程长的比色皿，吸光度大的溶液要用光程短的比色皿。
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