根据键合基团极性不同，化学键合相可分为非极性、中等极性和极性三类。

常用色谱柱有：ODS柱（C₁₈柱）C₈,C_4,C₂和苯基柱、氰基柱、氨基柱等

类型

                                 来源：材料与化学化工学院

制备柱（不用制备柱的不用看）

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这种色谱柱可用于大规模复杂样品的分离和制备，由于制备型色谱柱体积和重量都较大，使用过程中必须小心。这种色谱柱的两端结构完全一致，故用户可以自行确定色谱柱的入口和出口；一旦确定入口和出口后，使用过程中非特殊原因不要颠倒，否则易造成两端填料同时污染，不利于维护。

锥形柱

与传统的圆柱形柱不同，锥形柱是内径渐变的，导致流动相的线速度在柱内加速运动。内径渐变小的加速度为正，反之则反。制备级色谱的进样量一般是过载运行，导致分离效率下降，产品的纯度受到损失.样品的质量过载通常在色谱柱的人口处发生，在样品沿色谱柱向下流动过程中，由于流动相在色谱柱中对样品的稀释效应， 质量过载情况会逐步减弱.大入口锥型柱由于柱子入口处截面积较大，在柱容积相同的条件下，对样品的负载能力大于圆柱型柱，在相同的进样量时，柱效损失较小。

锥尾柱

在制备液相色谱中，色谱柱内径较大，而连接管线的内径较小，从大直径直接过渡到小直径，流体易产生涡流分散和局部滞留，柱效降低.锥型柱尾内径逐渐减小，避免了上述问题，很多的制备色谱柱都采用锥 型柱尾.

结构

HPLC色谱柱大多是用内壁经高度抛光处理的直不锈钢管，不锈钢可用于所有有机溶剂与大多数水性缓冲液。但是含氯的流动相会缓慢的腐蚀不锈钢材质（尤其在低PH值时）所以使用该类型流动相时应小心。也有用玻璃、玻璃衬里不锈钢与塑料制作的商品柱，用于可能与不锈钢发生反应的特殊样品。

    筛板是色谱柱中非常重要的部分，它的主要作用是封闭色谱柱的两头，防止填料微粒流失，一般是用具有特定粒度的不锈钢或者镍粉末在模型中烧结而成，颗粒间隙即为筛板的孔，筛孔应小于填料的直径，一般5 μm和3 μm的微粒分别用2 μm和0.45 μm孔径的筛板。

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填料

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目前HPLC分析中常用的几种填料类型主要包括：全多孔微球、薄壳型微球、灌注色谱填料等。其中由于全多孔微球填料很好的兼顾柱效、样品容量、使用寿命、灵活性等众多理想的性质，因此应用最为普遍。薄壳型微球仅适于分析性HPLC。灌注色谱填料非常适于蛋白质等大分子的制备分离，但用于小分子分析分离较少。

综合考虑柱效、反压和寿命等方面因素，目前约5μm粒径固定相在分析型HPLC中应用最为广泛，1.5 ～ 3μm左右的多孔或无孔微粒在快速分离中显示出较为明显的优势。粒度分布范围越窄，填充色谱柱床的稳定性越好、柱效越高，同时压力降最小，一般要求粒度分布范围不超过平均值的± 50％。

硅胶

硅胶及键合硅胶是开发最早、研究深入、应用广泛的HPLC固定相，这主要是基于硅胶基质良好的物理特性与完善的制备工艺。

大多数硅胶微粒的机械强度很高，可保证填充床长时间在很高的操作压力下工作，柱效保持稳定。同时，由于硅胶表面存在活性硅羟基，能够通过表面化学修饰引入种类繁多的、具有不同官能团的键合相。

未修饰硅胶表面化学性质随制备和处理条件不同而变化。水合硅胶表面存在三种硅羟基。

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多孔聚合物

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键合相

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非极性键合相

表面基团为非极性烃基，如C18 、C8等，主要用于RP色谱。 C18是最常用的非极性键合相，将十八烷基氯硅烷与硅胶表面的硅醇基经多步反应而成。

含碳量

根据R1、R2基团，含碳量可分为高碳、中碳、低碳型键合相：

中等极性键合相——常见的有醚基键合相，这类键合相根据流动相的极性，可作为正相或反相色谱的固定相，应用较少。

极性键合相——可作正相或反相色谱使用

氨基键合相： 

   硅胶-氨丙硅烷基[－Si－(CH2)3NH2] 

氰基键合相：

   硅胶-氰乙硅烷基[－Si－(CH2)2CN]

PH值使用范围

C₁₈柱PH值范围都在2~8，流动相的PH值小于2时，会导致键合相的水解；当PH值大于7时硅胶易溶解；经常使用缓冲液固定相要降解。

封 端

把填料的残余硅羟基采用封口技术进行端基封尾，可改善对极性化合物的吸附或拖尾；含碳量增高了，有利于不易保留化合物的分离；填料稳定性好了，组分的保留时间重现性就好。如果待分析的样品属酸性或碱性的化合物，最好选用填料经端基封尾的色谱柱。

色谱柱的平衡

反相色谱柱由工厂测试后是保存在乙腈/水中的。新柱应先使用10－20倍柱体积的甲醇或乙腈冲洗色谱柱。请一定确保您分析样品所使用的流动相和乙腈/水互溶。 

操作步骤：

a. 平衡开始时将流速缓慢地提高，用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线（缓冲盐或离子对试剂流速如果较低，则需要较长的时间来平衡）

b. 如果使用的流动相中含有缓冲盐，应注意用纯水"过渡"即每天分析开始前必须先用纯水冲洗30分钟以上再用缓冲盐流动相平衡； 分析结束后必须先用纯水冲洗30分钟以上除去缓冲盐之后再用甲醇冲洗30分钟保护柱子。

色谱柱的再生

    长期使用的色谱柱，往往柱效会下降（柱子的理论塔板数减低）。可以对色谱柱进行再生，在有条件的实验室应使用一个廉价的泵进行柱子的再生。

建议用来冲洗柱子的溶剂体积

色谱柱尺寸  柱体积  所用溶剂的体积

  125-4mm   1.6ml    30ml；  250-4 mm  3.2ml  60ml；  250-10mm   20ml   400ml

选择再生方法：    极性固定相（如Si，NH2*  ，DIOL基色谱填料）的再生： 正庚烷→氯仿→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→水**；    非极性固定相（如反相色谱填料RP－18，RP－8，CN等）的再生： 水→乙腈→氯仿（或异丙醇）→乙腈→水。

注意：a. 在对NH2改性的色谱柱进行再生时，由于NH2可能以铵根离子的形式存在，因此应该在水洗后用0.1M的氨水冲洗，然后再用水冲洗至碱溶液完全流出。

b. 0.05M稀硫酸可以用来清洗已污染的色谱柱，如果简单的用有机溶剂/水的处理不能够完全洗去硅胶表面吸附的杂质，在水洗后加用0.05M稀硫酸冲洗非常有效。

色谱柱失效症状

色谱柱压增高

峰变宽，拖尾，裂峰

塔板数下降，选择性下降，分离度降低

保留值减小或增大

色谱柱失效的原因

进口滤片堵塞

吸附了样品杂质

柱填充不良，使用久，

机械及热冲击造成空洞

固定相遭化学侵蚀

柱凹陷——出现裂峰现象，填料与色谱柱顶端不齐平，可用相同填料填平凹陷处。

压力影响——应避免突然的压力波动与任何的机械与热力冲击，如色谱柱掉在实验台上或骤然改变柱温等。进样过程中转动进样阀太慢引起压力波动，会使色谱峰产生裂隙。

柱压升高原因

强保留样品组分——强吸附组分易聚集在柱进口填料上，严重缩短色谱柱寿命。尤其是生物样品提取物、含油成分等。当严重拖尾峰出现时往往是强保留污染物在柱口处聚集的信号。

解决办法

使用保护柱可延长分析柱寿命。

每天实验后应用强溶剂（例甲醇-水等，至少20-30倍柱体积的量）冲洗色谱柱。

并定期进行保养，以低流速的强溶剂较长时间冲洗色谱柱。

样品纯度差——有微小的颗粒堵塞管路。

可用滤膜过滤样品后再进样。

样品浓度高——连续进样，造成过载。

如果样品吸收度不是太低，使样品浓度在1mg/ml以下较适宜。 

流动相中缓冲液浓度过高，有机相比例大——在色谱过程中堵塞管路，析出的盐结晶还磨损泵、进样阀密封圈造成漏液。

缓冲液浓度一般控制在20mmol以下较适宜，测定完毕后必须及时用水充分冲洗。

柱效低的原因

频繁更换流动相组成——加速柱效降低。

最好一根色谱柱使用的流动相成分和pH值相近，如始终在酸性条件下或碱性条件下工作。 

色谱柱的选择不合适或使用时间久

更换色谱柱（厂家，型号）

进样操作不当

转动进样阀时应一次转到位，不能过慢或停顿，否则易造成裂峰。  

样品溶剂与流动相成分不匹配

样品溶剂与流动相成分不匹配，造成前沿峰或倒峰。如样品用纯甲醇作溶剂，而流动相中甲醇比例很低，这样易出现前沿峰，改变样品溶剂成分或比例，使醇-水比例接近于流动相。

结果不能重现

   表现为同一样品溶液连续进样所得峰面积相差大，引起这种情况时，可从以下几方面来查找原因：

泵、进样阀、管路漏液——造成峰面积变化。

检测器灵敏度改变——如果同一样品两次进样峰面积相差10倍或更大倍数，则最可能的原因是检测器的灵敏度被无意中改变，软件的灵敏度改变不会影响峰面积的积分数值。

色谱软件积分方式是否一致——尤其是对于色谱峰较复杂的，积分时基线稍有变化将造成峰面积大的变化，如果两峰不是基线分离，则峰切割方式对峰面积有很大影响，有时候采用峰高较峰面积误差小。