【必看】一文读懂高效液相色谱基础原理

张明 2025-06-17

高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC）是色谱法的一个重要分支，应用范围十分广泛，对样品的适用性广，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，几乎所有的化合物包括高沸点、极性、离子型化合物和大分子物质均可用高效液相色谱法分析测定，因而弥补了气相色谱法的不足。在目前已知的有机化合物中，可用气相色谱分析的约占20%，而80%则需用高效液相色谱来分析。HPLC具有分离效能高、分析速度快、检测灵敏度好、能分析和分离高沸点且不能气化的热不稳定生理活性物质的特点，已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术应用。

基本原理

色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobilephase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationphase)发生作用(吸附、分配、排阻、亲和)的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。

高效液相色谱法以经典的液相色谱为基础，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有颗粒极细的高效固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。

图1.高效液相色谱仪分析流程

系统组成

HPLC系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。此外，还可根据需要配置梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、预柱或保护柱、柱温控制器等，现代HPLC 仪还有微机控制系统，进行自动化仪器控制和数据处理。制备型HPLC 仪还备有自动馏分收集装置。

图2.高效液相色谱仪的系统组成

1.输液系统

输液泵是HPLC 系统中最重要的部件之一。输液泵按照输出液恒定的因素分为恒压泵和恒流泵，泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结果的可靠性。

输液泵按工作方式分为气动泵和机械泵两大类。机械泵中又有螺旋传动注射泵、单活塞往复泵、双活塞往复泵和往复式隔膜泵。

表1.几种高压性能泵的性能比较

HPLC使用的输液泵应满足下列条件：

①流量稳定，其RSD 应＜0.5%，这对定性定量的准确性至关重要；

②流量范围宽，分析型应在0.1~10ml/min 范围内连续可调，制备型应能达到100 ml/min；③输出压力高，一般应能达到150~300kg/cm2；

④液缸容积小；

⑤密封性能好，耐腐蚀。

（1）往复式柱塞泵

活塞向外移动时，泵头出口单向阀关闭，同时流动相进入的入口单向阀打开，溶液（流动相）抽入活塞缸。当柱塞推入缸体时，入口单向阀关闭，出口单向阀打开，流动相被压出活塞缸，流向色谱柱。双活塞往复泵的输液流量比单活塞泵小得多。其优点是不必使用消除脉冲的阻尼器，避免了阻尼器的压力消耗，但缺点是设备成本较高，流量调节也比单活塞泵复杂。往复式柱塞泵的特点是不受整个色谱体系中其余部分阻力稍有变化的影响，连续供给恒定体积的流动相。

图3.单活塞往复式柱塞泵的构造（A）和双活塞往复式柱塞泵构造（a）及排液特性（b）

（2）隔膜型往复泵

隔膜型往复泵也是一种恒流泵，活塞与油接触，当活塞往复运动时，隔膜受到油压的作用，对流动相部分产生"吸引"或"推压"，使流动相部分的单向阀吸液或排液，从而获得稳定的液流。隔膜泵的活塞不直接与流动相接触，故不存在活塞密封垫磨损对流动相的污染。隔膜泵的死体积小（约0.1mL），因此，更换流动相后平衡快，有利于梯度洗脱。但隔膜泵结构比较复杂，价格较贵。

图4.隔膜型往复泵结构示意图

（3）气动放大泵

气动放大泵是一种恒压泵。泵头通常由两部分组成--单向阀和密封圈-柱塞杆。单向阀一般由阀体\塑料\或陶瓷阀座和红宝石球组成，在压力的作用下宝石球离开阀座，流动相流过单向阀；反之，在反向力的作用下，宝石球回到阀座上，此时流动相不再流过单向阀。

2.脱气装置

流动相溶液往往因溶解有氧气或混入了空气而形成气泡。气泡进入检测器后会在色谱图上出现尖锐的噪音峰。小气泡慢慢聚集后会变成大气泡，大气泡进入流路或色谱柱中会使流动相的流速变慢或出现流速不稳定，致使基线起伏。气泡一旦进入色谱柱，排出这些气泡则很费时间。在荧光检测中,溶解氧还会使荧光淬灭。溶解气体还可能引起某些样品的氧化或使溶液pH值发生变化。

目前，液相色谱流动相脱气使用较多的是离线超声波振荡脱气、在线惰性气体鼓泡吹扫脱气和在线真空脱气。

超声波振荡脱气：将配制好的流动相连容器放入超声水槽中脱气10-20min。这种方法比较简便，又基本上能满足日常分析操作的要求，所以，目前仍广泛采用。

惰性气体鼓泡吹扫脱气：将气源（钢瓶）中的气体（氦气）缓慢而均匀地通入储液罐中的流动相中，氦气分子将其它气体分子置换和顶替出去，而它本身在溶剂中的溶解度又很小，微量氦气所形成的小气泡对检测无影响。

真空脱气装置：将流动相通过一段由多孔性合成树脂膜制造的输液管，该输液管外有真空容器，真空泵工作时，膜外侧被减压，分子量小的氧气、氮气、二氧化碳就会从膜内进入膜外而被脱除。

图5.真空在线脱气装置示意图

3.梯度洗脱装置

HPLC 有等强度(isocratic)和梯度(gradient)洗脱两种方式。等度洗脱是在同一分析周期内流动相组成保持恒定，适合于组分数目较少，性质差别不大的样品。梯度洗脱是在一个分析周期内程序控制流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和pH 值等，用于分析组分数目多、性质差异较大的复杂样品。采用梯度洗脱可以缩短分析时间，提高分离度，改善峰形，提高检测灵敏度，但是常常引起基线漂移和降低重现性。两种溶剂组成的梯度洗脱可按任意程度混合，即有多种洗脱曲线：线性梯度、凹形梯度、凸形梯度和阶梯形梯度。线性梯度最常用，尤其适合于在反相柱上进行梯度洗脱。