成果介绍

（1）实验设计

50 只 SPF 级雄性 Sprague-Dawley （SD） 大鼠，年龄为 4-6 周，购自 SPF 生物技术有限公司（中国北京）。将大鼠随机分为对照组 （NC） 、模型组 （AD） 和 BC99 低剂量组 （AL） 、 中剂量组 （AM） 和高剂量组 （AH），每组 10 只。酒精度数为 53 的红星二锅头购自北京红星股份有限公司（中国北京）。大鼠维持饲料购自 SPF Biotechnology Co.， Ltd.。动物室保持 21-25 °C 的温度、48-55% 的湿度和 12 小时的光照/黑暗循环。

适应期1周后，模型组和对照组大鼠均于每日9 a.m通过灌胃给予生理盐水，3个BC99干预组根据大鼠体重每天灌胃106 、 107和108 CFU/g·bw的BC99细菌溶液，持续19 d。从第 15 天开始，对照组用生理盐水灌胃，模型组和 BC99 组以 8 mL/kg·bw 的剂量灌胃白葡萄酒，并在实验最后一天结束时将白葡萄酒剂量调整为 14 mL/kg·bw，以形成急性酒精性肝损伤模型。禁食大鼠 14 h，然后处死，收集血液、肝脏、回肠和盲肠内容物。随机选择 4 个样本用于相关指标的测定和分析 （n = 4）。

图1 实验设计图

（2）BC99 改善 AALI 大鼠的肝功能

实验期间大鼠体重的变化如图 2B. 通过管饲法饮酒后体重逐渐下降，尽管差异没有统计学意义。肝功能指数结果如图 2C-F 所示。与 NC 组相比，AD 组的 ALT、AST、LDH 和 TBA 水平显著升高（p < 0.001），表明饮酒导致严重肝损伤。相比之下，这些标志物在 BC99 治疗组中显著降低 （p < 0.05），降低对应于干预剂量。具体而言，与 AD 组相比，AH 组的 ALT 水平降低了 64.45% （p< 0.001）、AST 降低 33.09% （p < 0.001）、LDH 降低 34.4% （p < 0.001） 和 TBA 降低 44.98% （p < 0.001）。

通过肝组织 HE 染色进一步证实 BC99 对大鼠 AALI 的保护作用。不同放大倍数的肝脏组织病理学如图 2G，H 所示。NC 组的肝细胞排列有序，轮廓清晰，无变性或坏死迹象，细胞核大而圆。相比之下，AD 组的肝组织表现出明显的紊乱、肝细胞萎缩、基质细胞混浊和肿胀、广泛的坏死和细胞质密度降低，与酒精诱导的肝损伤一致。在 BC99 治疗组中，肝损伤明显减轻，显示坏死减少，肝脊髓排列有序，肝细胞从中央静脉放射。值得注意的是，AH 组的肝脏形态与 NC 组非常相似.

图2 BC99 改善了 AALI 大鼠的肝损伤

（3）对PAC-QOL和PAC-SYM评分的影响

从图 3A-C 中可以看出，AD 组大鼠肝脏中 ADH 和 ALDH 活性显著降低，而 CYP2E1 活性显著增加 （p < 0.001），但这种情况在 3 个 BC99 组中得到改善，其中 AH 组的 ADH 活性和 ALDH 活性分别增加了 64.07% 和 112.52% （p< 0.001）。同时，在 3 个 BC99 组中，只有高剂量组 CYP2E1 的活性与 AD 组显著不同 （p < 0.01），与 AD 组相比，CYP2E1 的活性下降了 16.84%。

进一步研究了 BC99 对 AALI 大鼠肝脏氧化应激的影响（图 3D-F）。总体而言，与NC组相比，AD组大鼠肝脏SOD和GSH水平显著降低（p<0.001）。与AD组相比，AH组大鼠肝脏SOD和GSH水平分别升高了89.86%和36.14%。此外，与NC组相比，AD组MDA浓度显著升高（p< 0.001）。与 AD 组相比，AH 组的 MDA 水平下降了 33.75% （p < 0.001），发现这种降低与剂量直接相关。总之，补充 BC99 成功地降低了肝脏中的氧化应激水平，但这与剂量有关。

图3 BC99 减轻了 AALI 大鼠的肝脏氧化应激损伤

（4）BC99 减轻酒精诱导的肝脏代谢失调

为了进一步了解凝结芽孢杆菌 BC99 改善急性酒精性肝损伤的保护机制，采用基于 LC-MS 的非靶向代谢组学方法提取和检测小鼠的肝脏代谢产物。

通过对样品的 PCA 分析，我们可以初步了解各组间代谢物差异的总体情况，这也可以反映每组内部的差异。PCA 结果显示，NC 组和 AD 组的样本部分重叠，这可能与急性酒精中毒模型有关，AD 组和 AH 组区分明显（图 4A）。为探究不同组间差异的本质，分别对 NC 组、AD 组和 AH 组进行监督正交偏最小二乘判别分析 （OPLS-DA）。根据 OPLS-DA 评分图，NCvsAD 组与 ADvsAH 组差异明显，提示 BC99 显著改变 AALI 大鼠肝脏代谢物的组成，其组成与 NC 组相似（图 4B，C）。根据 VIP > 1 和 p < 0.05，从在线数据库中筛选出潜在的生物标志物。差异代谢物集分析显示，在对照组和模型组筛选的 1041 个生物标志物中，502 个生物标志物上调，539 个生物标志物下调。从模型组和高剂量组中共筛选出 1007 个生物标志物。与模型组相比，BC99 干预导致 392 个生物标志物上调，615 个生物标志物下调（图 4D，E）。酒精和 BC99 干预都会导致肝脏代谢物发生显着变化（图 4F，G）。

图4  BC99 改变了 AALI 大鼠的肝脏代谢物

为了更好地了解生物标志物，我们专注于 AD 组和 AH 组之间差异代谢物的分析。我们进行了富集分析和拓扑分析，以确定与代谢物差异相关性最高的关键途径。结果表明，BC99 通过各种代谢途径改善了酒精诱导的失调代谢特征（图5A）。其中，影响因素> 0.1 的 7 条途径是丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、淀粉和蔗糖代谢、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、D-谷氨酰胺和 D-谷氨酸代谢、抗坏血酸和醛酸盐代谢、苯丙氨酸代谢、甘油脂代谢。这七种代谢途径涉及八种不同的代谢物，包括天冬氨酸、谷氨酸、L-天冬酰胺、葡萄糖、D-麦芽糖、D-葡萄糖醛酸、苯丙氨酸、甘油酸。随后，我们分析了相关代谢物的相互作用并整合了它们的主要代谢网络（图5B、C）。与 AD 组相比，AH 组 L-天冬酰胺、葡萄糖、D-麦芽糖、D-葡萄糖酮、苯丙氨酸和糖酸含量显著降低，而天冬氨酸、谷氨酸含量显著增加。

图5 BC99 干预 AALI 的主要生物标志物和代谢网络

（5）BC99 上调抗氧化相关基因水平

我们进一步探索了与肝脏氧化应激相关的基因水平（图 6A、B）。研究发现，酒精摄入降低 ADH 水平，增加 CYP2E1 水平，提示大量饮酒后，酒精主要通过 CYP2E1 通路进行，从而产生大量活性氧，对肝脏造成氧化应激损伤。此外，酒精显著抑制肝脏中 Nrf2 、 HO-1 、 Keap1 、 sod-3 和 Trx1 的表达，最终导致肝损伤。BC99干预组显著抑制CYP2E1基因表达，增加Nrf2、HO-1、Keap1、sod-3和Trx1基因的表达，其中高剂量组效果最好。以上结果表明，BC99 干预组可通过调节 Nrf2 通路和 CYP2E1 基因的表达来改善氧化应激。

图6 BC99 增强了 AALI 大鼠抗氧化相关基因的表达

（6）差异代谢物的 Spearman 相关性分析

我们实验室在急性酒精性肝损伤的早期获得了大鼠模型中 16S 肠道菌群的数据，并在本研究中分析了其与肝脏代谢物的相关性，以更好地解释差异代谢物的变化（图7A）。相关性分析显示，Glutamate与AH 组 Prevotellaceae_NK3B31_group、Ralstonia 和 Hydrogenophaga 呈显著正相关，与 AD 组 Fournierella 呈显著负相关。葡萄糖与 AH 组 Prevotellaceae_NK3B31_group 和 Hydrogenophaga 的不同细菌属呈负相关。苯丙氨酸与 AH 组中的不同细菌副拟杆菌之间存在显着的负相关。甘油酸与 AD 组中的不同菌株 Fournierella 呈正相关。研究证明，这些差异代谢物的变化可能与肠道菌群的差异有关。

此外，我们还分析了差异代谢物与氧化应激指数和肝损伤指数之间的相关性（图 7B）。研究发现，谷氨酸与抗氧化基因、SOD 和 GSH 呈正相关，与 ALT、TBA 和 LDH 呈负相关。天冬氨酸与抗氧化基因和 GSH 呈正相关，与 TBA 和 LDH 呈负相关。而 Glucose 与抗氧化基因、 SOD 和 GSH 呈负相关，与 ALT 、 TBA 和 LDH 呈正相关。这一结果表明，酒精性肝损伤可能与葡萄糖升高有关。两个氨基酸的变化可能是减少氧化应激和减轻肝损伤的原因。

图7 差异代谢物的 Spearman 相关性分析

（7）BC99 降低 N2 线虫中酒精诱导的氧化应激

我们使用 H2DCF-DA 探针来测量 ROS 的水平。与对照组相比，模型组的 ROS 水平显着增加 （p < 0.001）。与模型组相比，BC99 干预显著降低了 ROS 水平，而 BH 组降低了 49.51%（图 8A、B）。同时，结果显示线虫中 SOD 、 CAT 和 GSH 水平显着降低，MDA 显着增加 （p < 0.001）。BC99 干预后，BH 组的 SOD、CAT、GSH 和 MDA 水平已恢复到对照组的水平（图 8C-F）。以上结果表明，BC99 可以减轻酒精引起的氧化应激损伤，从而达到缓解酒精损伤的效果。

图8 BC99 增强了 N2 线虫中抗氧化相关基因和酶的水平

（8）BC99 对突变菌株氧化应激的影响显著减弱

在正常情况下，线虫中活性氧的含量处于动态平衡状态。37 °C 的高温会导致线虫代谢谱失调并产生大量活性氧，从而导致氧化应激和损失。因此，抵抗热应激的能力已成为线虫抗氧化活性的重要指标。为了证实 sskn-1、daf-16 及其下游靶标在 BC99 对酒精诱导的氧化应激的抵抗中的重要性，我们使用 CF1038 （daf-16（-） 突变体） 和 GR2245 （skn-1（-） 突变体） 进行了抗应激实验（图 9A-D）。结果表明，BC99 组和 模型 组之间两种突变菌株的平均寿命没有显著差异。BC99 已经失去了提高酒精诱导线虫抗逆性的能力。这些结果进一步验证了我们之前的结论。

图9 BC99 显著减弱了 GR2245 和 CF1038 突变体的抗氧化应激抵抗性

● 创新性/应用前景