完胜PCR实验的要点，谨记！

展源 2026-09-09

完胜PCR实验的要点，谨记！

PCR检测微量感染因子时，容易因为污染的而导致各种问题，因此，进行PCR操作时，操作人员应该严格遵守一些操作规程，最大程度地降低可能出现的PCR污染或杜绝污染的出现。

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种体外核酸扩增系统，其原理类似DNA分子的天然复制过程，是将在待扩增的DN 片段和与其两侧互补的两个寡聚核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。该技术已成为分子生物学中一种有助于DNA克隆及基因分析的必需工具。

基本原理

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。

在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：

1、模板DNA的变性

模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。

2、模板DNA与引物的退火（复性）

模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。

3、引物的延伸

DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。

重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。 每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

PCR的反应动力学

PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用 Y＝(1＋X)n 计算。

Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，

X表示平(Y)均每次的扩增效率，

n代表循环次数。

平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应” ，这种效应称平台期数、PCR 扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。

PCR的实验步骤

标准的PCR反应体系：

10X 扩增缓冲液：5μl
模板DNA: 0.1~2μg
引物：各0.2~1μmol/L
4种dNTP: 各200μmol/L
Mg2+:1.5mmol/L
Taq DNA聚合酶：2.5U
ddH2O ：补齐
总体积：50μl

※ 可以按照比例放大或者缩小体系，不同的PCR反应需要优化；按照实验方案进行即可。

操作步骤：

1、加样

将上述总体积为50чl的反应体系加入一无菌0.5ml离心管中。

2、离心

将加入的反应物混合均匀后稍离心，加入一滴矿物油覆盖于反应混合物上。

3、扩增

在PCR仪上设置PCR反应参数（具体数据根据引物和扩增片段的大小而定）：94℃下加热4分钟左右；依次94℃变性1分钟，45℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，循环32次左右；72℃下保温7分钟，使反应产物扩增充分。

4、PCR扩增产物分析

PCR产物是否为特异性扩增，其结果是否可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。

PCR仪器的热力学参数：

预变性： 94 ℃，3min，使DNA双链完全打开。

变性： 94 ℃变性，45s，使双链DNA解链为单链。

退火： 58℃，1min温度由引物长度和GC含量决定。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合，降低温度可增加反应的灵敏性。

延伸： 72 ℃，1min，温度为Taq酶最适反应温度72 ℃，时间由扩增片段的长度决定1min扩增1KB。

PCR 操作时应注意事项

1、划分操作区

目前，普通 PCR 尚不能做到单人单管，实现完全闭管操作，但无论是否能够达到单人单管，均要求实验操作在三个不同的区域内进行，PCR 的前处理和后处理要在不同的隔离区内进行：

① 标本处理区，包括：扩增摸板制备；

② PCR 扩增区，包括：反应液的配制和 PCR 扩增；

③ 产物分析区，凝胶电泳分析，产物拍照及重组克隆制备。

※ 各工作区要具有一定隔离，操作器材专用，要有一定方向性，如，标本制备→PCR 扩增→产物分析→产物处理。切记：产物分析区的产物及器材不要拿到其他两个工作区。

2、分装试剂

PCR 扩增所需要的试剂均应在装有紫外灯的超净工作台或负压工作台配制和分装，所有的加样器和吸头需固定放于其中，不能用来吸取扩增后的 DNA 和其他来源 DNA：

① PCR 用水应为高压的双蒸水；

② 引物和 d-NTP 用高压的双蒸水在无 PCR 扩增产物区配制；

③ 引物和 d-NTP 应分装储存，分装时应标明时间，以备发生污染时查找原因。

3、实验操作注意事项

尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因，样品间的交叉污染也是原因之一。因此，不仅要在进行扩增反应是谨慎认真，在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意。

① 一次性手套，若不小心溅上反应液，立即更换手套；

② 使用一次性吸头，严禁与 PCR 产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染；

③ 避免反应液飞溅，打开反应管时为避免此种情况，开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面；

④ 操作多份样品时，制备反应混合液，先将 dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度；

⑤ 最后加入反应模板，加入后盖紧反应管；

⑥ 操作时设立阴阳性对照和空白对照，即可验证 PCR 反应的可靠性，又可以协助判断扩增系统的可信性；

⑦ 尽可能用可替换或可高压处理的加样器，由于加样器最容易受产物气溶胶或标本 DNA的污染，最好使用可替换或高压处理的加样器。如，没有这种特殊的加样器，至少 PCR 操作过程中加样器应该专用，不能交叉使用，尤其是 PCR 产物分析所用加样器不能拿到其它两个区；

⑧ 重复实验，验证结果，慎下结论。

PCR 扩增重要标准

1、什么是PCR实验灵敏度?

灵敏度指的是PCR扩增反应能够检测到目的基因最小值。

研究结果表明，影响 PCR 扩增效率的因素，如，模板的复杂程度与完整性、引物纯度及其与模板结合效率、反应温度、DNA 聚合酶的热稳定性与扩增性能、反应缓冲液的离子组成（主要指：阳离子）、反应优化剂等，均决定 PCR 实验检测灵敏度。在最佳扩增条件下，常规 PCR 反应能够检测到 pg(10～12g)数量级目的基因。对于一个特定的目的基因，模板与引物通常都是已经限定好的因素。因此，选择什么样的 PCR 反应体系（包括：DNA 聚合酶与反应缓冲液等）就是研究者提高PCR 实验灵敏度的关键因素了。

2、什么是PCR实验特异性？

特异性指的是在 PCR 扩增过程中，专一性扩增目的片段而非其他片段的性能。

在 PCR实验本身的灵敏度很高，且实验条件未充分优化的情况下，通常会在目的片段出现同时伴随有其他杂带，即，发生非特异性扩增现象。模板、引物性质及质量、反应条件控制等均会影响 PCR 扩增特异性。近年，研究结果表明，缓冲液品质（如，离子种类与组成，反应优化剂等）对保证 PCR 特异性扩增起着不可忽视的作用。一般缓冲液中调节氢键作用盐只有 KCl，而东盛 HSTMTaq Mix 的缓冲体系通过反应优化剂以及 KCl/(NH4)SO4盐离子体系平衡调节，显著提高 PCR 扩增特异性，降低背景。

内容来源：网络

责任编辑：展源

审　　核：何发

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